植物寄生线虫鉴定identification of plant,parasitic nematodes

根据线虫的形态结构特征及对植物的寄生能力，确定供检对象在线虫系统中的分类地位。近代也有从线虫的生态特征、进化过程及线虫的生物化学、细胞遗传学和胚胎学等，试图解决形态相似的某些不同线虫种类的分类地位，探索更多的鉴定途径。但是迄今仍以形态鉴定为主，对植物外寄生线虫的鉴定，增加了寄生性的测定。
形态鉴定 主要有线虫样本采集、分离、杀死、固定和制片等步骤，其中以杀死和固定最为重要。
采样 采集植物线虫的场所主要是病变组织和病土壤。植物受线虫寄生为害后，在某些部位产生明显病变，可以直接采病变的组织或器官，如小麦粒线虫在虫瘿中，根结线虫在根瘤里，菊叶线虫在叶片组织内，松材线虫则在木材内； 但大多数植物寄生线虫外寄生于根系，长期栖息在根围土壤中，采样时主要取根和根围土壤。
采集线虫的时间根据具体情况而定。采集土壤，应选择线虫的某个虫态在田间发生的高峰期进行。如根结线虫等固定内寄生线虫选择二龄幼虫发生高峰期，其他外寄生线虫则在成虫高峰期为宜。高峰期出现时间可以根据线虫的发生世代预测。多数植物线虫的世代重叠比较重，在长江中、下游地区，6月至11月（线虫世代发生期）均可以从作物土壤中收集到线虫。采集病变组织，应在发病期间进行，新鲜的病组织内线虫相对较多，是采集的适宜时间。如松材线虫应取刚刚枯死或枯死不久的树木，小麦粒线虫在小麦开花后子房开始膨大时取样能获得大量成虫，小麦黄熟期只有幼虫存在于虫瘿中。
采集样本的方法，视采集对象不同而有区别。对于病变组织可直接采集新鲜发病部位，采时，应选好采集地点，一般是植物地上部分生长不良的地块为宜，平行跳跃式取样，用铲采集5厘米以下的植物根系土壤，取样采集、采集的样本应立即放入薄膜袋中，以防干燥。扎口后贴好标签、标明采集时间、地点、寄主名称、土壤类型等。需要邮寄的土样标本，连同薄膜袋一起放进布袋或木盒，及时投寄。不邮寄的样本要尽快分离或放进4℃左右冰箱中保存。
分离 分离的方法很多，每一种方法各有其优缺点，适应的范围和所需要的设备不同。可根据线虫种类、寄生特点选择简便易行的方法。
漏斗法 由贝曼(Baerman,1917)首创，是最早从植物组织和土壤中分离线虫的方法。适合分离能运动的线虫。该法出虫率低，一般用改进后的漏斗分离方法。分离时在漏斗内放大小适中的金属或塑料筛，筛上铺纱布或细纸，漏斗下面接一橡皮管，用夹夹紧，然后加样本于筛上，以水淹没后静置。由于线虫的趋水性和自身的重量，不断脱离样本，迁游到水中，最后集中沉降在橡皮管下端。该法简便，不需复杂设备，容易操作，缺点是漏斗内特别是橡皮管道内缺氧，不利于线虫活动和存活，有效分离率低，所获线虫悬浮液不干净，分离时间较长。如在水中加0. 15%双氧水(H₂O₂)可提高分离效果。
浅盘法 适合分离植物组织和土壤中能运动的线虫。原理与漏斗法相同。浅盘包括一盘一筛。在筛底铺纱布或纸，摊开样本后将筛放进盛有适量水的盘中，12～24小时后，从盘内水中收集线虫。这种方法由于筛、盘底面积较大，而且二底之间有一定空隙，氧气比较充足，线虫容易活动和存活，故分离效率比漏斗法高，但分离时间较长，所获线虫悬浮液较脏。
过筛法 适合分离土壤中运动和不运动的圆筒蠕虫形线虫。将土样放进盛有适量水的桶内，搅动至土块碎散，静置后将悬浮液过筛，洗下筛上残物，便可镜检。此法比较粗糙、简单，所获线虫悬浮液也脏，但广泛被采用，因为在较短时间内可以处理大量样本。
糖液离心漂浮法 将过筛法收集的线虫与残渣的混合液离心后去上清液，在底物内加比重为1.13或1.14的蔗糖液，重复离心一次，将上清液倒入325目或400目筛内，立即冲洗糖液，收集筛中残物。这种方法速度快； 出虫率高，能获得干净的线虫，对运动和不运动的线虫均适用，不足的是糖的用量大。此分离方法还可以直接把土样放入大离心管，分别加水和糖液离心两次，效果也较好。
漂浮分离法 限于分离土壤样品中胞囊线虫雌虫。利用风干土壤中的胞囊比水轻的原理，加水后胞囊上浮与下沉的土粒分开。把风干的土样通过奥斯坦布赖克(oostenbrik)漂浮器后，收集漂流进筛的残物过滤，在双目扩大镜下从滤纸上挑取胞囊。
解剖分离法 把洗净的病组织直接放入盛有适量水的培养皿内，置解剖镜下，用解剖针或小刀撕破或解开组织，剥取线虫或待寄生线虫离开组织进入水中后，用挑针挑取或用吸管吸取线虫。这种方法适合分离少量病组织中活动和不活动线虫。
杀死 线虫分离后可以直接检查，如果样本需要保存，就要将虫体杀死并固定，防止变形变质。当今都采用热能杀死线虫。杀死少量线虫，可以放载玻片上的水滴中，通过火焰上方加热即可杀死。大量的线虫，可以在皿内通过火焰边加热边观察，到线虫突然伸直停止活动，或呈弓形或螺旋形时，停止加热，观察到虫体仍不活动方可认为杀死线虫； 也可以用热水杀死，在线虫悬浮液内加沸水使温度为56～58℃,3分钟后放入冰箱或室温自然降温，待悬浮液冷却后立即加固定液固定。此外，也可以把4:1福尔马林冰醋酸(FA)固定液加热到99℃后倒入高度浓缩的线虫悬浮液中，在杀死线虫的同时进行固定。
固定 需要保存或用电镜观察的线虫，杀死后，随即进行固定。固定液种类很多，2%～4%的甲醛液是一种常用的固定液，优点是配制简单、使用方便，线虫在这种固定液中可以长期保存，缺点是时间长了有可能使虫体内部形成颗粒； 4:1福尔马林冰醋酸液是又一种常用固定液，可以长时间保存线虫原形，但可能使虫体颜色变暗； 福尔马林冰醋酸酒精液(FAA)用得也很多，但这种固定液可能使虫体皱缩变形，优点是可以保持线虫的刻线和环纹清晰； 三乙醇胺福尔马林液(TAF)是另一种适用的线虫固定液，短时间内能较好地保持线虫弹性，使之与活虫相似，但时间过长，会导致一些线虫内部结构透明和表皮角质膜变质。
为了方便，实验室中常用将固定液配成双倍浓度，使用时取与线虫悬浮液体积相等的液量，直接加入到线虫液中。
制片 制片是为了镜检线虫的形态特征。虫体玻片是多样的，有的是临时玻片，有的又起保存线虫标本的作用，称为（半）永久玻片。根据线虫形态鉴定的不同需要，玻片内的线虫可以是整体的，也可以是虫体的部分结构，如根结线虫的雌虫会阴区角质膜和胞囊线虫胞囊的后端部等。
用作永久玻片或半永久玻片的线虫标本，制片前还需要脱水。脱水的方法很多，共同特点是最后将虫体浸在甘油里，统称为甘油法。乳酚油(乳酸20毫升，苯酚20毫升，甘油40毫升，蒸馏水20毫升混合而成)也应用广泛，它既可作清洁剂，又可作脱水剂。常用的脱水方法如下。❶甘油酒精脱水法。把经过固定的线虫，移到甲溶液(95%酒精20毫升，甘油1毫升，蒸馏水79毫升混合成)，把器皿放在酒精饱和蒸气的密闭容器中，置于35～38℃恒温箱中，12～24小时后取出，除去多余甲液，加入乙溶液(甘油5份，95%酒精95份混合而成)，然后放进不密闭的容器中，室温下待酒精完全蒸发后，把线虫移入纯甘油。这种方法的优点是比较快(5～7天)，脱水效果好。如果中途发现虫体变形，可以回到甲溶液中重新脱水。
❷甘油慢速脱水法。把经过固定的线虫移到稀浓度甘油中，放进干燥器内，缓慢蒸发脱水。这种方法脱水效果很好，但由于所需时间太长(25～30天)，需要在脱水剂中加硫酸铜等防腐剂控制霉菌污染。
❸甘油快速脱水法。将脱水剂中的甘油比例由55%逐级增加到100%，将其它成分的浓度逐级减少到0%，配制成5种不同浓度的溶液(见表1)。线虫在每种溶液中处理10分钟。移到纯甘油后，立即放在干燥器中。这种方法效率很高，从处理到封固可以在一小时内完成。不足的是某些线虫在快速脱水中会变形或皱缩。

表1 5种溶液的配制比例

组分(g)	溶 液
	1	2	3	4	5
甘油 乳酸 苯酚结晶 蒸馏水 福尔马林	55 15 15 10 5	70 10 10 5 5	82 5 5 5 3	90 2.5 2.5 2.5 2.5	100 0 0 0 0

圆筒蠕虫状线虫的整体制片 制作临时玻片，用固定液或水作浮载剂，盖上盖玻片即可。制作永久玻片，需用甘油作浮载剂，把挑取的线虫在浮载剂中央排列整齐，四周放三根短玻璃丝呈放射状作为支架，方可加盖玻片。临时玻片可以用石蜡封固； 永久玻片需要用密封性能好的封固剂封固，如ZUT、中性树脂、白磁漆、电线漆等。
线虫横断面的制片 为了观察线虫某一部分横断面的特征，需要把要观察部分切下制片。在解剖镜下把线虫挑到透明塑料玻片的甘油中，用解剖刀切断虫体，把需要的一段挑到溶化的甘油明胶浮载剂中，用热金属丝将样本断面调整向上，加盖玻片，可以直接保存或封固后长期保存。
根结线虫会阴花纹的制片 将发育良好的雌虫移到透明塑料载玻片的乳酚油中，切下虫体未端的一小块，清除内含物后稍加整形，将留下的表皮移到甘油中，表面向上，加盖玻片后封固。
胞囊线虫肛阴门锥体的制片 胞囊线虫肛阴部位的饰纹与根结线虫的花纹区别很大，但切割虫体的方法相似。把经过软化的胞囊放在乳酚油或福尔马林液中，切下肛阴部分后，移入另一盛上述福尔马林中修整，放进100%酒精中硬化后，转入丁香油中透明，最后移到加拿大树胶浮载剂中，表面向上，待沉浸后加盖玻片封固。
镜检 在植物寄生线虫的分类鉴定中，常着重检查其雌虫的外部形态和内部结构。因为不少线虫的雄虫稀少、情况不明或者没有发生（孤雌生殖），也有的在形态上明显退化。线虫形态结构复杂，可以用作分类的内容多样，特别是消化系统和生殖系统的形态特征，在线虫鉴定中有着重要意义。已知植物寄生线虫2600多种，分布在垫刃线虫目，滑刃线虫目和矛线虫目之中。属于垫刃目的占大多数，矛线目的只有二类线虫寄生植物。三目线虫的主要鉴定特征见表2。

表2 垫刃目、滑刃目、矛线目的重要区别

	垫刃目	滑刃 目	矛线目
食性	多数寄生植物，部 分寄生昆虫和脊椎动 物，也有腐生类群	取食真菌，腐生、寄 生昆虫、寄生植物	腐生、肉食寄 生藻类、苔藓、少 数寄生植物根部
背食道腺开 口位置	开口于口针基部球 后方食道前体部的食 道腔内	开口于中食道球瓣 门稍前的食道腔内
卵巢数 交合伞	1或2条 多数有	1条 多数没有，少数有 助骨（乳突）支撑的交 合伞，或有离开肛区 的端交合伞	1或2条 有或无
引带	有	多数没有	多数没有

对于线虫的细微形态结构，利用电子显微镜进行检查日益普遍。如扫描电镜能直接观察线虫唇区构造和角质膜线纹等表面的立体结构，透视电镜能观察线虫的肌肉、口针等内部结构。在线虫学中，扫描电镜应用更为广泛，某些线虫类群虫属和种的准确鉴定很大程度上依赖于电子扫描技术。
用于电子显微镜观察的样本需要经过特殊制备，而且供扫描电镜和透视用的样本准备程序也不尽相同。用作扫描电镜样本的制备主要包括杀死、固定、脱水、干燥、粘样和镀膜等步骤。线虫样本要清洁，杀死时尽量使之快死，避免线虫在死亡时挣扎造成扭曲。固定需要用双固定法，即先用3%戊二醛液固定，再用锇酸液固定。经过2次固定，使线虫体内蛋白质分子和不饱和脂肪酸稳定，防止虫体变形。常用的脱水剂是丙酮或乙醇，样品在5～6级的浓度中各处理15～20分钟后，置丙酮原液中处理3次。干燥线虫样本常用临界点干燥法，即用液态二氧化碳逐步置换样本中的脱水剂，再将置换的样本放在耐高压的容器内，一定量液态二氧化碳封闭容器并加热，待达到临界温度后，稳步排除二氧化碳气体，使样本变得干燥。干燥后的样本用银粉胶粘贴到样品台上，然后用金镀上一层薄膜，以增强样本的导电性，得到清晰的图象。
线虫透视电镜样本的制备包括杀死、固定、脱水、树脂渗透，超薄切片和染色。杀死、固定和脱水的方法与扫描电镜的制样方法相同。用环氧树脂进行树脂渗透，再按常规法超薄切片，最后用醋酸铀和柠檬酸铅进行双重染色。
寄生性鉴定 是研究植物病原线虫中常用的方法，每种线虫都有一定的寄主范围，通过人工接种证明某种线虫可寄生一定种类的植物引起发病，从而确定线虫的分类地位。植物病理学中称为致病性测定。在植物病原线虫的研究中，通常需遵循柯赫氏法则。首先明确可疑线虫对病害的关系，其次要确定可疑线虫的寄生可能性，如果有线虫成为病原体的话，就必须是植物寄生线虫。第三，要确定寄主一寄生线虫的相互关系。这一阶段要建立病害的病原学。通过上述三阶段的工作，证实所研究的线虫是不是某种植物的病原线虫。
植物病原线虫的接种技术应用很广，除致病性测定需要接种外，寄主范围的测定，寄主对线虫的抗病性，线虫病的流行条件和防治等研究都需要进行必要的接种工作。病害的发生是病原线虫与寄主植物相互作用的结果，而病原线虫和寄主植物都受环境条件的影响，因此接种能否成功与寄主植物的感病性，病原线虫的接种量和致病性，发病的环境条件关系极为密切。
不同植物对同一种病害的感病程度不同，同一种作物不同品种的抵抗力也不一样，接种时应选用最易感病的品种，为了保证接种的成功，通常在植物发育的感病时期接种，需要时接种感病程度不同的品种以便比较。接种体的数量一定要达到引起发病的最低量，一般接种时都应规定一定的接种量，有利于实验的重复和相互比较。每种病害的发生都需要一定的环境条件，环境条件又从多方面影响病害的发生和发生程度。接种时，为了有利于病原物的侵入为害，应尽量模仿该病原线虫在自然情况下侵染寄主所需要的条件，其中温度和湿度条件最为重要。一般讲，大田接种应在温度适合发生该病的季节进行，实验室可以人工控制温度； 接种后应在一定时间内保持接种部位的湿润条件。
植物线虫的接种方法与线虫病害的传染方式和侵入途径有关，在研究线虫参与的复合侵染中，还要混合接种线虫与其他病原物。
土壤接种法 适合接种为害植物根部或从地下部位入侵的线虫。在播种时或在苗期用带线虫的材料或人工培养的线虫接种土壤，如盆栽接种小麦胞囊线虫、在土中混入定量的胞囊，播种后保温保湿即可，用病土播种小麦也会成功，小麦粒线虫的接种可将麦种与虫瘿混播； 根结线虫的接种可以将根结组织切成小段接在播种或移栽沟内，播种或移栽后，保温保湿。
喷雾或滴注接种法 适合接种为害幼芽和叶片的线虫。将人工培养的线虫悬浮液用滴注或喷雾法接种。如草莓芽线虫的接种。
伤口接种法 在植物健康的组织上钻小孔或造成伤口截面，将线虫悬浮液灌注到孔内或伤口截面上。如破坏性茎线虫、松材线虫的接种。
线虫与其他病原物的混合接种 在诊断植物线虫与其它有害生物共同引起的复合病时用混合接种法。如小麦蜜穗病菌的接种，是将小麦粒线虫的虫瘿和蜜穗病细菌与小麦种混合拌匀后播种。
其他鉴定途径 在植物线虫的分类鉴定中，除以形态特征为主要依据外，近期还推出了采用线虫生态学、生物化学、细胞遗传学和胚胎学特征为依据的分类法，但应用很少。线虫行为学和生态学有时在垫刃目线虫分类中比较重要。
细胞遗传分类学方法 通过研究线虫染色体数目、形态和繁殖方式对线虫进行分类鉴定。目前已经在异皮线虫科和根结线虫科的分类和形态学方面获得可行的资料。细胞遗传分析也能区别线虫的种或致病型。采用以染色体数目为基础，以会阴花纹和2龄幼虫特征为辅助特征，能准确无误地鉴定根结线虫的种或小种。如用染色体特征可以准确区分花生根结线虫的A小种和B小种。A小种具有三倍体的染色体，其数目为3n=50～56,B小种具有2倍的染色体，数目为2n=34～37; 又如花生根结线虫的染色体在形态和行为上与爪哇根结线虫的极相似，但后者的染色体数目为2n=43～48，数目不相同，因而测定染色体数目是区分这两个种的基本工作。
生化分类学方法 主要是运用凝胶电泳技术进行分类鉴定，这种方法比较简单，而且很快可以获得线虫蛋白质和酶的特征。目前主要用于区分异皮科和根结科线虫的种和致病型(pathotypes)。
进化分类法 近年来也被引入线虫的分类鉴定中，传统的方法是把线虫的形态特征与化石资料作比较。这是一种通过建立祖先—后代分类系统来连接过去和现在的方法，积累的资料可以作为一个种群生态树(genealogical trees)。实际中，利用化石作线虫分类依据是很难得出系统发育结论的。
此外还有系统发育分类法，是解释分类单元之间或内部相似之处。尽管有诸多的分类方法，但目前仍然没有哪一种方法可以取代以形态为基础的分类法。