蛋白质合成的步骤

细胞内蛋白质合成是在核糖体上进行的非常复杂的过程，包括多肽链合成的起始、延伸和终止三个步骤。不仅需要携带特定遗传信息的mRNA、各种氨基酸和tRNA，以及ATP、GTP，每一步骤都需要专一的酶和辅助因子参加（见表）。核糖体象一架复杂而精巧的合成蛋白质的分子机器，各种分子必须按一定的时空秩序排列在核糖体的特定位置上，协同活动，并按mRNA携带的遗传信息的指令精确地完成多肽链的翻译(图1)。

图1 细菌细胞内DNA、mRNA、RNA聚合酶与核糖体共同组成一个合成蛋白质的分子机器

蛋白质合成就是在不断生长着的肽链上从氨基端到羧基端逐个加上氨基酸的过程。有ATP存在时，氨基酸被氨酰—tRNA合成酶激活形成氨酰—tRNA。每种氨酰—tRNA合成酶都有高度的专一性，它能从20种氨基酸中选出仅仅一种氨基酸，然后选出相应于这种氨基酸的一种tRNA。这样，许多tRNA分子运载着各自特异的氨基酸，提供蛋白质合成的原料。
蛋白质合成是从附着到mRNA核糖体的小亚基上开始的。在起始因子的参与下，一种特殊的起始tRNA携带着相应的氨基酸与mRNA的起始密码子结合并占据重新形成的70S核糖体的P部位，形成有功能的核糖体。这就是蛋白质合成的起始阶段。按mRNA密码子顺序规定的下一个氨酰—tRNA，在延伸因子参与下，同核糖体的A部位结合，于是便进入蛋白质合成的延伸阶段。然后，核糖体上的肽基转移酶再将这个新加入的氨酰—tRNA上的氨基和紧靠前面一个氨酰—tRNA上的羧基共价连接，形成一个肽键。在另一延伸因子作用下，核糖体沿mRNA移位，露出一个新的密码子。上述肽链延伸过程又得以周而复始地进行，直至达到mRNA的终止密码为止。此时，在终止因子的作用下把一条完整的多肽链释放出来。

大肠杆菌蛋白质合成各主要步骤必需之成分

时 期	必需成分
在细胞液相内进行 氨基酸的激活	氨基酸 tRNA 氨基酰—tRNA合成酶 ATP Mg2+
在糖核体上进行
1.多肽链的起始	原核生物 fMet—tRNA (真核生物Met—tRNA) mRNA之起始密码子(AUG) mRNA GTP Mg2+ 起始因子(IF—1, IF—2, IF—3) 核糖体30S亚基，50S亚基
2.延伸	有功能的70S 核糖体为密码子选择 的氨基酰—tRNA延伸因子(EF—T 和EF—G) GTP
3.终止	有功能的70S核糖体mRNA的终止 密码子，多肽释放因子(R1,R2,R3)

各种生物蛋白质合成的机制十分相似。有关蛋白质合成的知识主要是从大肠杆菌 (E.coli) 和网织红细胞的离体系统研究得到的。现以前者为例将蛋白质合成步骤分述如下。
多肽链合成的起始 蛋白质合成时，70S核糖体处于不断地解离和重聚的平衡中。多肽链合成开始前，70S核糖体必须先解离成50S和30S亚基。起始氨酰—tRNA不能直接和70S核糖体结合；它必须先和30S亚基结合，然后才能再和50S亚基结合。这是一个十分复杂的过程，需要有三个特殊的可溶性蛋白质，称为起始因子(简称IF—1,IF—2，和IF—3)参加； 它们的分子量分别为9000、65 000和21 000。
30S亚基先和IF—3结合，再依次与mRNA、IF—1结合，形成一个复合物。起始氨酰—tRNA先和IF—2、GTP结合形成一个复合物，再加入到上述30S亚基复合物，形成所谓的起始复合物。此起始复合物再同50 S亚基结合，恢复一个完整的有功能的70S核糖体。在这一过程中GTP水解成GDP和Pi，以供应所需的能量；三个起始因子(IF—1,IF—2和IF—3)也从核糖体上解离下来，再循环使用(图2)。

图2 起始复合物与有功能的70 S核糖体（大肠杆菌）的形成复合物

原核生物的起始密码子AUG编码N-甲基甲硫氨酸，而真核生物则编码甲硫氨酸。起始过程要求保证携带着起始氨基酸的tRNA能准确地结合到核糖体的肽基P部位，并与起始密码子AUG配对，使mRNA翻译能正确地进行。mRNA密码阅读是从5′端到3′端进行的。因此，核糖体的P和A部位应能识别mRNA链的方向性。
肽链的延伸循环 当起始氨酰—tRNA结合到P部位，与mRNA密码配对，下一个氨酰—tRNA进入到70S核糖体的A部位时，肽链延伸便开始了，延伸过程又可分为以下三个步骤：见图3。

图3 肽链延伸的几个步骤

(1) 氨酰—tRNA的结合： 新加入的氨酰—tRNA与70S核糖体上空出的A部位结合是一个复杂的过程。首先，新加入的氨酰-tRNA要和细胞质内的一个专一的蛋白质，称为延伸因子T(简称EF—T)结合。EF—T是由EF—TS和EF—TV两个亚基组成的。EF—T先和GTP结合，形成EF—Tu—GTP复合物，并释放出EF—TS,EF—TV—GTP，再与氨酰—tRNA结合，形成包含四个成分的EF—Tu—GTP—氨基—tRNA复合物。后一复合物再同核糖体结合，把氨酰—tRNA正确地安放在A部位上，并使tRNA的反密码子和mRNA相应的密码子配对。与此同时，结合在复合物上的GTP水解成GDP和Pi，并以EF—TO—GDP的形式脱离核糖体。GTP水解产生的能量供给氨酰—tRNA安放在A部位时的需要。氨酰—tRNA和A部位结合能被某些抗生素，如四环素阻遏，而使蛋白质合成受到抑制。真核细胞的延伸因子称为EF—1,EF—2，其作用方式略有不同。
(2)肽链的形成：这一反应是由核糖体50S亚基固有的肽基转移酶催化的。在酶作用下，位于P部位的甲酰甲硫氨酰—tRNA转移到新进入到A部位的氨酰—tRNA的氨基上，形成二肽基—tRNA。同样的过程在每一个延伸循环中出现，即新入到A部位的氨酰—tRNA的氨基置换位于P部位的肽基—tRNA的tRNA，形成一个新的肽链。于是，肽链靠着在羧基端逐次增加一个氨酰—tRNA而得以延长。
嘌呤霉素的结构与tRNA末端腺苷酸的氨基酰衍生物很相似，因而能参加这些反应，和肽基—tRNA共价结合，形成肽基—嘌呤霉素(图4)。然而，这一产物不能被核糖体上的移位装置识别而转移到P部位上去，结果就从核糖体上被释放出来，从而阻断了肽链的延伸。嘌呤霉素抑制蛋白质合成的方式有力地证明肽链的延长是靠在羧基端逐次增加氨酰—tRNA进行的。
(3) 移位：新的肽链刚形成时，已延长的肽基—tRNA仍然结合在A部位上。下一步需要核糖体的移位，沿mRNA移动一个密码子的距离，并使肽基--tRNA从A部位移到P部位。移位是一个复杂的过程，需要细胞质内专一的蛋白质，延伸因子G(EF—G)和GTP参加。EF—G先和GTP结合，形成的复合物再结合到核糖体上。GTP水解，释放出GDP、Pi和EF—G脱离核糖体。所产生的能量供给核糖体移位时发生构象变化的需要。随着核糖体的移动，肽基—tRNA从A部位移到P部位，空出来的A部位及mRNA上新露出来的一个密码子又可以接受一个新的氨酰—tRNA，开始一轮新的延伸循环。
总之，肽链的延伸要求核糖体上与肽基—tRNA，氨酰—tRNA,mRNA，延伸因子以及GTP结合的各个部位在时空关系上密切配合。在肽链延伸的每一轮循环中，核糖体可能在构象和空间关系上发生复杂的变化。
多肽链的终止 肽链延伸反应不断进行，直到mRNA上的终止信号(UAG、UAA或UGA)出现在核糖体A的部位上。一般情形下，细胞内没有氨酰-tRNA能阅读这一信号，而只有可溶性蛋白质释放因子，才能阅读这种信号。细胞内有三种释放因子R1、R2和R3，它们同核糖体结合，并使肽基—tRNA从A部位移到P部位。同时，肽基转移酶被活化，多肽链和末端tRNA之间的酯链被水解，释放出一条合成完毕的多肽链(图5)随着末端tRNA和mRNA离开核糖体，空载的70S核糖体便解离成50S和30S亚基。在专一的起始因子和mRNA存在时，新的多肽链又可能开始合成。

图4 嘌呤霉素抑制蛋白质合成的机制
嘌呤霉素与氨酰—tRNA分子相似并能和肽基—tRNA反应，形成肽基—嘌呤霉素。由于此多肽链不能进一步延长，结果肽基—嘌呤霉素便脱离核糖体

肽链合成过程中，消耗的能量是由ATP和GTP供给的。在氨基酸激活反应中，每形成一个氨酰—tRNA要消耗两个高能磷酸键。此外，每一个氨酰—tRNA和核糖体A部位的结合，以及在mRNA上移位，又要消耗两个GTP。因此，每形成一个肽链总共要耗费四个高能磷酸键，相当于30.54×4=122.16 kJ(7.3×4=29.2kcal)的能量。由此可见，细胞为了保证mRNA的遗传信息能精确地翻译成蛋白质的氨基酸顺序，在能量上付出的代价是很高的，远超过了其他生物合成过程的能量消耗。据估计大肠杆菌的25%—30%重量是核糖体，生物合成消耗的90%能量是用于蛋白质合成。
为了简化起见，上面叙述的只是在核糖体上发生的蛋白质合成。实际上，细胞内蛋白质合成是在许多个相连的核糖体上同时进行的。当开头的一个核糖体上肽链延伸到一定长度，并且核糖体沿着mRNA移动足够长的一段距离时，mRNA上的核糖体结合部位又空出来了。于是，第二核糖体又附着上去。如此往复进行，结果一个mRNA链上可以同时附着许多个核糖体(其数目视mRNA链长度而定。可以从3—4个到100个)，形成多聚核糖体。在mRNA链上等距离排列的许多个核糖体，在从5′端到3′端移动的过程中，循序阅读mRNA上的遗传密码，先后各自合成一条完整的多肽链(图6)。一个多聚核糖体就象一条蛋白质合成的生产流水线，许多核糖体，一个接着一个地沿着mRNA从5′端向3′端移动，每当一个核糖体达到终止信号时，就释放出一条新合成的多肽链。在一条mRNA链上同时有多个核糖体在工作，显然提高了mRNA样板的利用率，加快了细胞内蛋白质的合成速度。

图5 合成完毕的多肽链释放的步骤

已知mRNA的合成和解释过程都是从5′端到3′端的方向进行的。因此，从mRNA合成开始后，翻译也就可以随着同时进行。Miller等在电子显微镜下观察大肠杆菌基因的活动，发现mRNA从3′端开始合成，逐渐延长的过程中，其5′端就与核糖体结合，开始蛋白质的合成(图7)。因此，在原核细胞mRNA的转录和解释可以同时偶联地进行。

图6 多聚核糖体。五个核糖体从5′端到3′端移动过程中，同时阅读mRNA并合成多肽链

当多肽链还正在核糖体上合成的时候，就已经可能开始折叠，形成二级和三级结构。然而，从核糖上释放出来的多肽链其侧链往往还要经过种种修饰(形成二硫桥，侧链的羟基化，乙酰化，甲基化，磷酸化和加糖等)，以及分子的构造、亚基聚合加辅基，才能成为有功能的分子。
某些多肽链在翻译后，要在特定部位经过一次或连续几次酶切，切除一个或几个肽段后，才能转变成有功能的分子。例如，胰岛素的A链和B链是从同一条多肽链胰岛素原，经过酶切，切除一段C链而产生的。从胰凝乳蛋白酶原转变成胰凝乳蛋白酶是一个更为复杂的过程，胰凝乳蛋白酶原先经胃蛋白酶的作用，断裂成两条被二硫键连起来的多肽链，称为π-胰凝乳蛋白酶。后者再通过自身催化，切除两个二肽，产生三条相连的多肽链，转变成有消化酶活性的α-胰凝乳蛋白酶。

图7 细菌基因活动的模式图

某些具有亚基结构的蛋白质，其多肽链在翻译后，经过自发的相互作用，此时，不可能需要再装上辅助基，才能最终成为有功能的蛋白质。