茶叶酶类enzymes of tea

茶叶化学成分之一，是茶树组织内部自身形成的一类生物催化剂。茶叶中含有的大量茶多酚、咖啡碱、蛋白质以及脂肪等各种有机物， 都是在相应的酶的参与下进行生物合成的； 组织内各种物质之间的相互转化、分解以及异构化作用， 也是通过酶反应而完成的， 茶组织内部各种代谢过程所以能有条不紊地进行， 也是通过酶的调节、控制而实现的。离体后的茶叶， 在酶尚未钝化之前， 仍具有酶的活力， 并继续参与物质的转化和降解作用。各种特征迥异的茶类， 就是以控制酶反应的程度为前提的。在加工过程中一直保持酶的活力， 促进酶反应的进行而制作的茶， 即发酵茶， 包括各种品名和级别的红茶； 加工之始， 就完全停止酶反应而制作的茶， 即不发酵茶（绿茶）；适当控制酶反应的时间和强弱而制作的茶， 即半发酵茶， 包括乌龙茶和黄茶。
各种生理生态条件， 各种作用物，包括基质浓度、抑制剂（包括蛋白质沉淀剂）、温度、酸碱度、光线等都能影响酶的活力， 更为剧烈的条件， 可以引起酶蛋白的变性乃至失活， 因此， 每一种酶都有它最适的温度、解质反应(pH)和最适的底物（基质）浓度。
茶叶中业已研究的、与形成茶叶品质有关的内源酶主要有以下15种。其中茶多酚氧化酶、过氧物酶、脂肪氧合酶、醇性脱氢酶是与红茶加工有关的； 苯丙氨酸解氨酶、5-脱氢莽草酸还原酶是与儿茶素形成有关的； 肽酶、核酸酶、甲基转移酶、谷氨酸-乙胺合成酶、丙氨酸脱羧酶是与氮代谢有关的酶类。
茶多酚氧化酶(polyphenol oxidese) 又称儿茶酚氧化酶(系统分类为E、C、1、10、3、1)，邻-二酚酶， 邻-二酚受氧氧化还原酶。其主要作用是在茶叶加工中将黄烷醇类物质氧化成氧化反应的中间产物，并且与氨基酸、胡萝卜素、脂类偶合产生氧化降解， 进一步形成香气物质和茶黄色素物质， 该酶系由5种以上同工酶组成， 主酶分子量130000～160000, 大部分位于叶表皮细胞质内，有的与过氧物酶体结合在一起，为一种含铜的酶类。该酶对茶黄烷醇B环上的邻二羟基具有显著的专一性； 除黄烷醇外， 儿茶酚、没食子酚均可作为基质，但对没食子酸和绿原酸则无作用。对儿茶素的氧化活力以d-儿茶素最高 (最小浓度为5×10-³M), 但不同的同工酶对各种儿茶素氧化速率不同， 最适温度35℃；最适pH为4.6～5.6，能被氰化物、二乙基二硫甲酸盐、抗霉素A或高浓度的基质所抑制。
幼叶中酶活力较成龄叶高， 随叶位逐渐下降； 茎中酶活力最高。酶活力具有季节性变化， 夏季高于春季； 适做红茶的品质， 酶活力亦高。在制茶过程中，酶活力随适度萎凋而增强， 用蛋白质形成抑制剂杀稻瘟菌素或嘌呤霉素可抑制酶活性， 同时在萎凋中形成新的同工酶谱带， 均说明有新的酶蛋白形成； 揉捻后逐渐下降， 最终， 与多酚类物质形成不溶性酶复合蛋白而丧失活力。
栽培条件能引起酶活力的改变， 遮荫处理可提高酶的活力。多酚氧化酶在红茶加工过程中的作用和变化研究较为详尽，但是它在活体茶株内的生物学意义，也如同茶树何以要形成如此大量的茶多酚一样， 仍然不十分清楚。
过氧物酶(peroxidase) 又称受体， H2O₂氧化还原酶。它是在H₂O₂存在下催化基质氧化的一种血红蛋白 (系统分类为E、C、1、11、1、7)。在茶株各部位和器官中均有分布， 但以根内活性较高。酶活性随叶龄和生育时期而异。70年代初始获得可溶态酶，平均分子量在50000之间， 系由6～7种同功酶组成；用DEAE-或C M-纤维素分离出6种，用凝胶电泳分出7条谱带。经两种纤维素吸附后洗脱的酶液，最适pH分别为4.1～5.0和5.4～6.2, 最适温度27～30℃。已发现该酶有催化儿茶素氧化的活性， 但高浓度的儿茶素氧化产物对该酶有抑制作用。对酚酸(绿原酸、咖啡酸、没食子酸等)具有较强的活力， 在同功酶中， 有两种可催化根皮酚的氧化。
在红茶加工过程中， 同功酶谱有明显变化， 在发酵的头1小时同工酶谱B带酶活力迅速增高， 2小时后其他酶带活性下降时， 仍然维持较高的活力。鉴于过氧物酶在红茶加工过程中可除去发酵期间形成的过氧化物， 所以近年来已利用该酶由新梢直接制作速溶红茶。
脂肪氧合酶(lipoxygenase) 它是催化18碳不饱和脂肪酸最终形成六碳醛酶系中之一种 (系统分类为E、C、1、13、11、12)。它在上述酶系统中的作用，是将亚麻酸 （或亚油酸） 通过酶的氧合作用， 在13碳位上形成13-L-亚麻酸过氧化物，后者再经脂酰基水解酶、过氧物裂合酶的作用形成顺-3-己烯醛， 再经异构酶转变成反-2-己烯醛 （叶醛）。该酶具有较强的专一性， 从末端甲基数起第6个碳原子上具有顺-1-和顺-4-位的戊二烯酸系才可作为基质并形成C₆醛。该酶与叶绿体膜层结合较为紧密， 至1982年尚未获得游离的单一酶制剂。酶活力随季节而变化， 7～8月活力最高， 冬季下降为零； 不同品种酶活力不同， 随叶片成熟其活力增高，如按单位酶蛋白比活力计算，各部位活力大致相同， 以叶绿体单位计算， 活力递减， 可见该酶与叶绿体蛋白形成有关。茶叶萎凋过程中随失水活力增高， 该酶最适pH6.5～7.0, 最适温度40～45℃, 硫酸铜对该酶有抑制作用。
醇性脱氢酶(alcohol dehydrogenase) 又称醇性辅酶、Ⅰ氧化还原酶(系统分类为E、C、1、1、1、1)。该酶对茶叶中醇、醛等香气成分的形成有重要作用，它催化无环的萜烯醇， 如橙花醇香叶儿醇、香茅醇以及顺-3-己烯醛、反-2-己烯醛等的醇、醛氧化还原反应，但对环式单萜烯类则很少或完全不起催化作用。
由茶籽中获得该酶的纯品。测得其分子量为150000，系由分子量各为47000的两个亚基组成。在以NAD为氢受体时最适pH为9.2, 低于pH4.0活力消失；以pH6.0～9.0最稳定。pH5.0时酶活最高。—SH基试剂有抑制作用，高浓度的硫脲、硫氰酸钾有轻弱抑制作用，O-二氮杂菲， 8-羟基喹啉有抑制作用， 说明该酶含有金属离子，由于酶受Ag+、Hg2+、Cu2+ 的强烈抑制， 估计是一种含Zn的酶类。在5.0×10-5～5.0×10-³M范围内，在以NAPH为辅酶时，完全不受影响，但以NAD为辅酶时， 则有抑制作用。
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammenialya-se) 为儿茶素生物合成中的重要酶类，它催化苯丙氨酸脱氨，形成反-苯丙烯酸进一步形成黄烷醇， 本质素等化合物 (系统分类为E、C、4、3、1、5)。新梢中的酶活力与儿茶素含量正相关， 红茶用品种酶活力高(儿茶素含量较绿茶高1.3倍， 酶活力高1.6倍), 遮光处理， 儿茶素下降， 酶活力亦降低； 用茶愈伤组织也表明， 生长初期， 酶与形成黄烷酮、儿茶素和花白素有关， 晚期与形成木质素有关。采摘后， 嫩梢和老叶酶活力表现不同， 前者下降， 后者增高， 用杀稻瘟菌素S抑制酶效应亦不相同， 说明嫩梢有酶不活化体系的形成。虽已获得可溶态酶，但仍有大量的酶是与叶绿体结合在一起的，该酶最适pH8.8, 最适温度37℃，萎凋期间（常温下）酶活力明显下降， 3小时后下降至原活力的26%。该酶对L-苯丙氨酸是专一性的， 在其他植物中虽发现与绿原酸形成有关， 但在茶树体内关系不明显， 在pH8.8硼酸缓冲液中， 测得其米氏常数值为1.1±0.1×10^-4M。
5-脱氢莽草酸还原酶(5-dehydro-shikimatereductase) 为茶叶黄烷醇类生物合成中的关键性酶类。它的作用是催化茶树体内存在的莽草酸脱氧，通过苯丙酮酸途径等形成黄烷醇类化合物。它以NADP为辅酶，故又称莽草酸-NADP氧化还原酶(系统分类为E、C、1、1、1、25)。该酶在芽叶各部位的活性，如按单位鲜重或单位酶蛋白活力单位计算， 则组织越嫩， 酶活力越高；并随芽叶成熟而逐渐降低， 老叶中的酶活力只及嫩叶的1/5; 如按单个叶片总活力计算，则以第三叶活力最大， 并与儿茶素总量相一致。1966年已获得可溶态酶， 在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中最适pH10.1, 在Tris缓冲液中为pH 7.7; 米氏常数Km （莽草酸）为0.43mM, Km(NADP)为32μM。砷酸盐和碘代乙酸有轻微抑制作用， 但可被0.33mM的对-氯汞苯完全抑制，加10mM半胱氨酸可得到恢复，说明该酶含有硫醇基。
肽酶(peptidase) 将蛋白质分解成游离氨基酸的酶类。酶活力随茶梢不同部位而异， 其中， 芽的活力最高，茎最低，但成熟叶（第二叶）占总新梢活力百分比最大。不同品种间肽酶活力差异较大， 有的高出35%。1964年获得不溶性酶，测得最适pH为5.0，最适温度52℃，保温1.5小时后， 始表现出最大酶活力， 因此预示着茶叶中具有两种或两种以上分解不同肽键的肽酶存在。
核酸酶(nuclease) 因为它对3′-单核苷酸有活性， 早期又称3'-核苷酸酶， 是一种核酸内切酶类，(系统分类为E、C、3、1、30、1)，该酶的主要作用是水解核酸成单核苷酸。
用葡聚糖凝胶G-100X羧甲基纤维素、二乙基氨基纤维素等均可获得两种核酸酶，分子量分别为35000和330000。两种酶对RNA、天然或热变性DNA水解的最适pH分别为6.0、5.5、6.0；对3'-核苷酸中GMP、CMP的pH为6.0, AMP和UMP为pH6.5, 在较酸的解质中不稳定，pH6.0～8.0较稳定。两酶中A酶最适温度70℃,B酶60～70℃，两酶高于80℃(15分钟) 酶活性丧失80%。Cu2+、Mg2+、Mn2+、Co2+对酶有抑制作用； Fe3+和Cu2+最有效。Zn2+对抑制天然DNA水解有轻微活性， 但对RNA、变形DNA和3'-核苷酸有很强的抑制作用。任何金属离子均不表现促进作用， EDTA可抑制酶活性。碘代乙酸抑制轻微，但对-氯汞苯抑制较强。
甲基转移酶(methyltransferase) 茶咖啡碱和嘌呤类核苷酸、核酸合成代谢中的重要酶类， 它能催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到7-甲基黄嘌呤形成可可碱， 进而转化为咖啡碱、黄嘌呤、黄嘌呤核， 黄质核苷酸、次黄嘌呤均可作为甲基受体； 其中副黄质是最佳受体， 但1-甲基黄嘌呤都很少或不形成副黄嘌呤， 因而排除了副黄嘌呤是咖啡碱的先质可能性。已从茶叶中获得了两种甲基转移酶， 两酶具有相同的酶学特征； 最适pH8.4, Mg2+、Mn2+ Ca2+有轻微激活作用， 但并不必需。米氏常数因所用基质不同而异；7-甲基黄嘌呤Km为10×10^-3M; 可可碱1.0×10^-3M; 副黄嘌呤0.2×10-³M; S-腺苷甲硫氨酸0.25×10-⁴M。
谷氨酸-乙胺合成酶(L-glutamate ethylamineligase) 即茶氨酸合成酶(系统分类为E、C、6、4、1、6)。它在谷氨酸和乙胺的存在下， 可催化二者的结合，形成茶氨酶， 反应中需要ATP和Mg2+。该酶的最适pH为7.5, 米氏常数如下： L-谷氨酸Km为4.6×10-³M; Km（乙胺）3.1×10^-4M;Km(ATP)6.7×10-4M。该酶具有较强的基质专一性， 其他单氨基二羧酸均不能取代L-谷氨酸； 氨、羟氨、联氨、脂族二氨和脂族氨基酸在相当于乙胺的浓度下， 亦均无反应。乙醇氨有显著抑制作用， 正-丙胺产生竞争性抑制， 说明该酶对脂肪族氨基亲合力较强， 本酶与谷酰胺合成酶无关。
丙氨酸脱羧酶(Lalanine decarboxylase) 茶氨酸形成过程中所需的乙胺， 是由丙氨酸脱羧而形成的，催起这一反应的就是L-丙氨酸脱羧酶。用酶液与L-丙氨酸(U-14C)作用后， 形成了带标记的乙胺和14CO₂, 因而证实。
该酶在幼苗中活力较高， 最适pH6.25(pH6.0或6.5都只有最适pH活力的一半)。磷酸吡哆醛对酶无促进作用。
果胶酶(pectase) 其作用是将果胶质脱甲基，形成甲醇，果胶质变成果胶酸，故又称果胶-甲酯酶(系统分类为E、C、3、2、1、15)，酶活力以芽和第一叶为高， 茎中因含大量果胶， 故酶活力也最强。果胶酶活力高的品系， 因形成果胶酸的胶质亦多， 阻碍氧的吸收， 故发酵性降低， 但有利于甲醇等香气物质的形成和保持。
该酶受儿茶素及其氧化产物的抑制，最适pH6.8，最适温度45℃; 80℃5分钟完全失活。
叶绿素酶(chlorophyllase) 又称叶绿素-叶绿素酸酯水解酶(系统分类为E、C、3、1、1、14)。该酶主要是催化叶绿素的水解和叶绿醇、香叶基香叶醇的醇基转移作用。过去只能用去污剂和有机溶剂才能获得可溶态酶， 故一般认为该酶是与叶绿体膜层结合在一起的。最近获得了可溶态酶， 特异性略有差异。
用不同的方法获得的可溶态叶绿素酶，都有两种，分子量分别为910000和350000以及和一个亚基 (亚基分子量38000)；两种酶具有相同的米氏常数、等电点和最适pH, 也有可能是两种同工酶。两种酶的最适pH为5.5（醋酸缓冲液）, 米氏常数10μm，最适温度45℃,50℃5分钟仍然稳定， 70℃有65%酶失活。该酶不需-SH基激活。
酶活力有季节性变化，并与叶绿素含量呈反相关。
超氧物歧化酶(superoxide dismutase) (系统分类为E、C、1、14、1、1)。据认为与儿茶素形成有关，可解除活性氧的伤害作用。因为叶绿体借光反应还原CO₂, 在强光和低CO₂浓度下， 氧首先被还原， 形成超氧物游离基O-2, 它常给作物造成伤害。超氧物歧化酶可催化O-2的不均化反应， 使O₂形成¹O₂，并抑制羟基游离基OH的形成，减少O₂的伤害，光可促进儿茶素的形成，并且伴随有羟基化作用，因此与本酶关系密切。已从茶叶中分离出三种同工酶， 其中两种是含铜和锌的酶 (占总酶的80%), 另一种含锰。酶活力因叶龄(1叶高、4叶低)、树龄、品种而异。
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase) 是与有机酸代谢有关而适应性很广的酶类，(系统分类为E、C、1、1、1、37)。经纯化后获得其两种脱氢酶， 测得其分子量为140000和70000，以后者活力较高。该酶最适pH8.0～8.4，是一种易受pH影响的可逆性离解酶类。酶离解时出现不活化的亚基， pH恢复后，亚基重新组合成活化状态。该酶受AMP、ACP、ATP、柠檬酸、顺-乌头酸和延胡索酸等的抑制， 表明， 在体内受三羧酸环和核苷酸的调节与控制的。
茶叶中业已研究过的酶类还有很多， 如酸性磷酸酯酶(aphosphatase)(E、C、3、3、3、2)、抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase),(E、C、1、10、3、3)以及转氨酶、亮氨酸-α-酮戊二酸转氨酶、谷氨酰转移酶、根皮酚氧化酶、香豆酸水解酶、草酸脱羧酶以及酯酶等。
除了上述茶树体内存在的内源酶以外， 随着速溶茶制作工艺的发展， 已从各种微生物等植物中提出和制备了大量的外源酶， 应用于制茶工艺流程。其中，应用较多、较为成功的有： 单宁酶、纤维素酶、多酚氧化酶等。单宁酶大都由霉菌属中分离获得， 它在加工中用以破坏单宁-咖啡碱形成冷浑沉降物之间的氢键，以制取清澈的速溶冰茶。该工艺已取得多项专利， 并已获得固相化酶。纤维素酶大多从麸霉菌种中获取，用以分解茶叶中的原果胶和胞壁， 使细胞内含物完全离析出来； 采用这些工艺， 可使速溶茶可溶物提高10～20%。从各种植物来源(马铃薯、蚕豆、大枫树、苹果、霉菌等)制取的多酚氧化酶， 已用于速溶红茶的加工，同时， 已研制成功从鲜叶或成品绿茶直接加工成速溶红茶的工艺， 并取得了许多专利。

茶叶酶类enzymes of tea

茶叶化学成分之一，茶树体内自身形成的一类生物催化剂。茶叶中已发现的酶类有20多种，主要有：
❶多酚氧化酶。是一种含铜酶，能催化酚类物质的氧化聚合，对构成发酵茶、半发酵茶的品质有重要作用。
❷过氧化物酶。为含铁卟啉的结合蛋白质，对红茶品质形成有一定作用。
❸脂（肪）氧含酶。是催化十八碳不饱和脂肪酸最终形成六碳醛酶系统中的一种酶，与茶叶香气有关。
❹5-脱氢莽草酸还原酶。为茶叶中类黄酮化合物合成中的关键性酶类。
❺苯丙氨酸解氨酶。与儿茶素的形成关系密切。此外，还有谷氨酸—乙胺合成酶即茶氨酸合成酶、果胶酶、叶绿素酶、超氧化歧化酶等。