细胞群体动力学中的核素示踪技术

细胞群体动力学（细胞动力学），是近二十多年来生物学发展的一个分支。它从定量角度研究各种细胞群体的动态过程(包括增殖、分化、迁移及死亡等)以及体内外因素对这些过程的影响和调控。通过细胞动力学的研究，可以揭示正常及异常细胞增殖的特点及规律，为疾病的防治、提供理论依据。
细胞增殖分为三类：
❶不再增殖的细胞，如神经元细胞、红细胞、多形核白细胞等；
❷需要时可增殖的细胞，如肝、肾等实质细胞，正常时绝大部分处于静息状态；
❸不断增殖、更新的细胞，一方面不断增殖，一方面不断有分化、丢失和死亡，以维持其相对恒定，如骨髓造血细胞、小肠腺窝细胞等。肿瘤细胞兼有后两类的特点。细胞动力学研究的对象主要是后两类细胞。
细胞周期： 是指细胞一次分裂结束后开始，到下一次分裂终止所经历的过程，按顺序可分为： DNA合成前期(G₁期),DNA合成期(S期),DNA合成后期(G₂期)及分裂期(M期)。各期所需时间分别为tG₁、t_S、tG₂及t_M，整个周期的时间为tC。哺乳动物细胞周期时间差别很大，关键在t_G1的变异。t_G1可由数小时至数天或更长，胚胎细胞甚至接近零。这可能和G1期中有一个限制点有关，各种体内外因素往往作用于这一点而影响细胞周期。

图1 细胞周期示意
1. 离周期 2. 丢失 3.进周期

有时细胞可脱离增殖周期，称为G₀期细胞，但仍保持其原有代谢特征。有些G0期细胞在一定条件下又可重新进入周期而增殖，有些则终止于G₀期，最后趋于死亡。有些癌的G0期细胞对放疗、化疗不敏感，往往成为复发的根源。
细胞增殖的动力学参数： 反映细胞增长规律的主要参数，除细胞周期各期的时间最为重要外，还有：
IM: 有丝分裂指数，也记为MI。
I_s: ³H-胸腺嘧啶核苷处理后的标记指数，也记为LI或IL。
I_p: 增裂分数，表示细胞群体中有增殖能力的细胞分数，也记为GF。
K_B: 平均新细胞出生率。
K_G: 平均细胞增殖率。
K_L: 平均细胞丢失率，K_L＝K_B-K_G。
t_L: 细胞平均寿命，表示细胞出生到衰老死亡、丢失的平均时间。
测定细胞动力学参数的核素示踪方法 测定细胞动力学参数的方法很多，核素示踪法是其中很重要的一类，它的几个有代表性的方法如下：
(1)标记有丝分裂百分数法： 简称PLM法，是测定细胞周期时间应用最广的一种方法。其原理是： 3H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)与待测细胞作短暂接触 （一次注射或短期体外培养），使在该段时间内正处于S期不同阶段的全部细胞中DNA被²H标记，而当时处于其他时期的细胞则不带标记。在多余的³H-TdR被除去后的不同时间取样作细胞放射自显影，找出正处于有丝分裂的细胞，计算其中带³H标记的细胞占有丝分裂细胞的百分数。由于S期细胞需经过G₂期才开始有丝分裂，故开始一段时间标记有丝分裂百分数为零(见图2.a)。当开始出现标记有丝分裂细胞时，表示原来处于S期最后阶段的细胞已渡过G₂期进入M期，故这一时间间隔即为tG2 (见图2.b)。 此后原处于S期其他阶段的细胞陆续进入M期，标记有丝分裂百分数逐渐上升，达到最高点时，说明原处于S期末阶段的细胞已完成有丝分裂而进入G₁期，故从开始出现标记有丝分裂细胞到开始出

图2 左侧图表示标记的细胞队列
及细胞运转的过程；右侧图表示相
应的PLM对时间标绘的曲线，粗
黑线代表PLM的变化

现最高百分数的这一时间间隔即为tM(见图2.c)。当该百分数从最高点开始下降，表示原处于S期最初阶段的细胞亦已开始有丝分裂，故从出现标记有丝分裂细胞到百分数开始下降的时间间隔为tS(见图2.d)。此后一段时间，标记有丝分裂百分数逐步下降到零，直到原处于S期末阶段的细胞进行第二次有丝分裂，才再次出现标记有丝分裂细胞，故两次开始出现标记有丝分裂细胞的时间间隔为tC(见图2.e)。最后计算t_G1,t_G1＝t_C-(t_S+t_G1+M)。

图3 L615第五天³H-TdR
标记分裂细胞百分率曲线

实际测量时，图形常不象图2所示那样整齐。由于一个细胞群中不同细胞的t_c及各阶段的时间都参差不齐，第一个峰的标记有丝分裂百分数常达不到100%，而且以后的峰常呈衰减现象（人类的细胞甚至第二峰也不明显）(见图3)，故细胞周期各时间参数在图上尽可能用半高度时的宽度来读取(见图3)。
t_G2、t_S和t_C可以直接读数（后两者利用平行四边形对边相等的原理）, tM则根据1/_2tM+t_G2的读数减去t_G1求出，也可用公式计算。最后计算t_G1,t_G1＝t_C-t_S-t_M-t_G2。
(2) 双标记法： 先使被测细胞与³H-TdR接触（一般是整体注射），经过≤tG1的时间(ta)(一般为15～30分钟)后再使细胞与¹⁴C-TdR接触（注射或取出细胞在体外培养时加入），经过一短时间后，进行双标记自显影(见“生物医学中的放射自显影术”条)。在自显影中可见到三种标记的细胞： 被³H标记的G₂期细胞，被¹⁴C标记的S期开始阶段的细胞，及被两种核素同时标记的S期细胞（除开始阶段外）。计数仅被³H标记的细胞求得百分数，代表在ta时间内由S期进入G₂期的细胞流出量。于是可用下列公式求得ts:

式中N_3H为仅被3H标记的细胞数，N¹4C为仅被¹⁴C标记的细胞数，而N3H·₁4C为3H和¹⁴C双标记的细胞数。若细胞增殖很快，呈指数规律增长，则t_S须经校正。
本方法简便易行，只须一次取材，而且有时用PLM法不适宜（如某些人体细胞）的实验，本法可得较满意的结果。
(3) 3H-TdR标记的迁移追踪法： 利用³H-TdR单次脉冲标记的迁移追踪法可以研究增殖细胞群体发展的流速以及细胞成熟到消亡的时间。以小肠上皮细胞为例，细胞更新起源于小肠的腺窝部。最底部为无增殖能力的潘氏细胞，其上为增殖区，再上为成熟区，成熟区以上为功能区，即绒毛柱状上皮细胞。给小鼠注射3H-TdR后不同时间取肠段作放射自显影，开始时标记细胞仅限于腺窝下2/3，随时间的推移，标记沿绒毛上升，约30小时标记的前沿到达绒毛顶端，此后放射性进入肠腔，说明标记细胞脱落。这种实验一方面可说明细胞更新的方式，另一方面也可得到细胞从成熟到消亡的时间。精原细胞发展到精子各阶段的时间、皮肤细胞的更新等，也可用类似的方法研究。
(4) ³H-TdR体外标记法： 把正常活跃增殖的细胞或肿瘤细胞在体外培养，加3H-TdR使之短期接触，通过放射自显影法测定IL，了解其增殖状况，可帮助了解药物、辐射及其他因素的影响，判断疗效及预后。此法也有用于实体瘤者，但实验的具体操作较困难。
细胞动力学原理在临床上的应用 细胞动力学原理在实践中已获得较广泛的应用，在有关疾病的诊断、预后、提高疗效方面都取得了明显的效果。
肠腺窝细胞动力学的变化和癌变有密切关系，例如溃疡性结肠炎、家族性结肠多发性息肉，在转化为癌之前，甚至在息肉形成之前首先出现异常的细胞动力学变化。用体外³H-TdR标记放射自显影法可见结肠腺窝的增殖区扩大，甚至标记细胞出现在粘膜表面，迁移率增快，因此可用于癌变发生的预测。
实验证明，白血病患者在诊断之初如果骨髓细胞IL高者化疗效果好，缓解快，这和细胞群体GF值大，处于增殖状况的细胞多，易受化学药物的攻击有关。
已知细胞周期各阶段对放射线的敏感程度不同，G2期和M期最敏感，S期抗辐射最强。化疗药物也可分为细胞周期特异性药物(CCSA)和细胞周期非特异性药物(CCNSA)。所谓CCNSA，除少数例外一般也有其最敏感的时相。因而细胞动力学的规律可为放疗及化疗治疗方案的制定提供一定依据。白血病在化疗时，根据不同的白血病类型、细胞动力学规律，采用不同的治疗方案，可减少治疗的盲目性，从而提高疗效。
在白血病的化疗中，由于化学药物对肿瘤细胞及正常骨髓细胞杀伤并无选择性，因此可以利用它们的tC的差异设计化疗方案，采用“联合化疗”(数种CCSA和CCNSA相结合)、“序贯给药”（按一定次序和时间间隔给药）。白血病细胞tC一般为60小时左右，比骨髓干细胞tC 24～36小时要长，用药后，虽然两者均遭到大量的杀伤，停药后残余的骨髓干细胞和白血病细胞开始增殖，但正常细胞tC短，分裂快，待数量接近正常时，癌细胞恢复少，这时再进行第二次给药杀伤，这样反复杀伤，可明显提高疗效，而骨髓细胞接近正常。又例如绒毛膜上皮细胞癌的细胞周期时间为144小时，采用每隔48小时化疗一次的方案，有可能得到根治。用氨甲喋呤治疗银屑病时，利用同样的原理也获得了良好的疗效。
此外，用3H-TdR标记法研究精子发生的动力学和药物对它的杀伤和阻断作用，对控制人类的生育有很大的意义。细胞动力学的研究阐明，抗体的形成和抗体形成细胞的增殖速度密切相关，而不是由于原有细胞的复苏和增加个别细胞抗体合成率所致。
细胞动力学作为指导化疗的理论基础，还有许多问题有待解决。肿瘤化疗最大的缺点是无区别地杀伤，因而可严重破坏机体的免疫机能，使感染成为严重的威胁。此外，细胞动力学缺乏考虑肿瘤细胞的耐药性的形成，一旦耐药性形成，将不服从药物杀伤的一般规律。
近年来的研究倾向于扩大化疗药物对肿瘤细胞和正常增殖细胞的区别杀伤，已出现了一些苗头。例如用某些药物有可能使正常细胞周期受到干扰进入静止状态，而癌细胞不受干扰依旧运转。在此条件下便可用中毒剂量大量杀伤癌细胞，而正常细胞受到保护。这一试验一旦获得成功，将在肿瘤化疗中跨出重要的一步。另一种扩大区别杀伤的途径是用体内细胞同步化的方法，使肿瘤细胞和正常增殖细胞分别同步化分裂，再利用CCSA选择肿瘤细胞最敏感的时期大量给药，这种方法也在试验阶段。