电泳法

带电荷的粒子在电场中移动称为电泳。此现象早在上世纪初即被发现，到本世纪三十年代才用U形玻管作血清蛋白电泳，利用适当的光学系统观察到清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白等4～5个峰。这是自由电泳或界面电泳，不需支持物，但要精巧的电泳仪，价值昂贵。至1948年有人开始应用滤纸作为支持物，简化电泳技术，从而被推广应用，这种电泳把多个组分在滤纸上分离为多条区带，所以称为区带电泳。此后有用琼脂胶、淀粉胶等作支持物的淀粉胶电泳、琼脂胶电泳等，现在用聚丙烯酰胺凝胶作支持物的电泳更为普遍。此外，还发展了等电聚焦电泳和等速电泳等技术。
电泳法主要用于分离各种有机物和无机物，氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸和核酸等均可用电泳分离。电泳也可用以分析一些物质的纯度，还可用来测定分子量。电泳法与其他技术也可结合应用，如电泳与层析结合的“指纹法”，与免疫技术结合的免疫电泳都是医学科学中的重要研究技术。
带电粒子在电场中所受力F是该粒子所带电荷Q和电场强度X之乘积： F=QX。而半径为r的球形粒子在粘度η的介质中以速度v运动时，其所受阻力F′按Stokes定律为6πγην。这是在自由溶液中的情况，若是凝胶则不完全遵守该定律，此时F′尚与凝胶的密度及颗粒大小等有关。当粒子以均速移动时，F=F′; 所以 QX=6πγην。而粒子的迁移率（或称淌度）m则是在单位电场 (V/cm)下测得的速度v (cm/s)。因此m=v/X，即m=Q/6πγη。可见迁移率与电场强度成正比而与介质粘度和粒子半径成反比。同时，移动速度v为单位时间t（以秒计）内移动的距离d(以cm计)，即v=d/t。电场强度X则是单位距离(以cm计) 内的电势差(以V即伏特计)。当距离为1cm，电势差为E伏特，则X=E/1。因此，m=V/X
若两种粒子A和B在电场中移动距离分别为d和dB。与B的迁移率决定了两者在电泳中是否可被分离开。若dA等于dB则不能分离； dAdB则可分离。同时A与B的分离与电压和电泳时间成正比，与电场的距离成反比。影响电泳的因素很多，下面简述主要的几种：
❶介质的pH对电泳的影响显而易见： 以氨基酸为例，当介质的pH等于某氨基酸的等电点，则该氨基酸所带净电荷为零，在电场中既不移向阳极也不移向阴极。当介质的pH大于该氨基酸等电点，氨基酸带负电荷，是阴离子而向阳极移动； 而当介质pH小于其等电点时，氨基酸带正电荷，作为阳离子而泳向阴极。由氨基酸组成的蛋白质也具有两性游离性质，因此蛋白质的电荷量也受介质pH值的影响。由此可见电泳中维持介质的pH甚重要，为此要采用一定pH的缓冲液。例如分离血清蛋白质时常用pH8.6的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨甲烷缓冲液。
❷缓冲液的离子强度也影响粒子在电场中移动速度。缓冲液浓度高则缓冲容量大，利于维持pH恒定； 但其离子强度高，降低电动电势，电动电势小则泳动速度慢。离子强度Ⅰ与离子克分子浓度C_i和离子价数Z_i的关系为I=1/2∑CiZi2。上式表明多价离子增高离子强度，因而电泳用缓冲液多采用单价离子化合物配制，而常用的离子强度在0.02～0.2之间。
❸电场强度对电泳速度起着决定性作用； 电场强度越大，带电粒子泳动越快，这点可从QX=6πrηv的关系上看出。另一方面，在电泳过程中产生的热量随电压的增高而增加。热不仅可引起如蛋白质等物质的变性，而且使缓冲液过多蒸发，电泳支持物上(如滤纸、薄膜)离子浓度增高，支持物吸引液体的毛细管现象等，从而影响物质的分离。因此，电场强度大于50V/cm的高压电泳要有冷却装置以克服上述弊病。
❹对区带电泳，电渗可影响泳动速度。支持物多孔结构的表面吸附了水中的正离子或负离子，使溶液相对带电，所以在电场作用下，溶液视其所带是正电荷或负电荷而向阴极或阳极移动，这种现象称为电渗。如在纸电泳，滤纸上吸附了OH-而带负电荷，而相邻的水溶液带正电荷而向阴极移动并可携带粒子同向移动。因此电泳粒子的表现速度是该粒子本身的泳动速度与由电渗时溶液所携带的移动速度之和。若两者方向相同，则表面速度比泳动速度大，反之则小。以不带电的物质如葡聚糖等作电泳则可测出电渗的方向与速度。
区带电泳 按其支持物的物理性状不同可区分为：
❶滤纸及其他纤维(如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维)薄膜电泳；
❷ 粉末电泳： 如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳；
❸凝胶电泳： 如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳；
❹丝线电泳： 如尼龙丝、人造丝电泳。还可按支持物的形状与放置形式不同区分为：
❶平板式电泳： 板状支持物水平架于电极槽上，是最常用的方式。
❷垂直板式电泳： 板状支持物垂直放置，电极槽一上一下，聚丙烯酰胺凝胶电泳常用此方式。
❸垂直柱式电泳； 柱状支持物垂直放置，聚丙烯酰胺盘状电泳属此。还可按电泳中pH是否连续而分为连续pH电泳和非连续pH电泳。前者整个电泳过程中pH保持不变，通常的纸电泳、纤维素薄膜等属此，而后者缓冲液和支持物间采用不同pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳属此。等电聚焦电泳也是非连续pH电泳，它利用人工合成的两性电解质，通电后形成一定的pH梯度。
聚丙烯酰胺电泳 区带电泳中支持物可减小对流与扩散的作用，使分离效果更好； 但是对支持物要求其结构均一并且在化学上对被分离物是惰性的。聚丙烯酰胺能满足这要求。其凝胶的密度和孔径（有分子筛作用）可以控制得均一，而且它在化学上是惰性的。因此在目前，聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用得最广泛的。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体CH₂＝CH₁—CO—NH₂聚合成长链聚丙烯胺，并籍加入适量的交联剂如常用的甲叉双丙烯酰胺CH₂＝CH—CO—NH—CH₂—NH—CO—CH=CH₂(Bis) 交联而成的。聚合是由自由基引发的反应； 聚合作用有化学聚合和光聚合两种方式。化学聚合由过硫酸铵催化，并加脂肪族叔胺如四甲基乙二胺作为加速剂。过硫酸铵溶于水中即形成自由基： S₂O₈^2--→2SO₄-·。当这些自由基与丙烯酰胺反应，自由基保留在丙烯酰胺上，从而可以不断与其他丙烯酰胺聚合成长链如下：这些多聚物长链溶液虽然粘稠但并不形成凝胶，要把这些长链交联起来方可成凝胶，加入Bis就可达此目的而成凝胶（见下页结构式）。
光聚合常用核黄素为催化剂，光照后可产生自由基而引发聚合作用。反应中丙烯酰胺浓度决定多聚链的平均链长而Bis决定交联度，从而决定凝胶的密度、孔径、弹性和机械强度。胶体性质可用T和C两项表示。T为总单体(丙烯酰胺与Bis)的百分浓度，而C是交联剂Bis对T的重量百分数。通常T为3～25%，低于2.5%则即使C增至20%也不成凝胶。C大于10%时，胶体脆且不透明，若低于1%则胶体软、机械性能差，难于处置。
聚丙烯酰胺电泳装置可有水平板式、垂直板式和垂直柱式等，水平板式可在平板端或中央上样品 （样品在当中可向两边泳动），装置简便； 垂直板式或柱式对运用多相缓冲体系较方便，但样品只能向一方向泳动。板式

与柱式相比则具有可在同一条件下同时放置多个样品。最简单的聚丙烯酰胺电泳是采用均一的胶体和一种缓冲体系。这种体系除简便外还有如下优点： 在这种体系，缓冲液的组成精确可知，pH在整个电泳过程中恒定不变。这对某些只在有限pH范围内才稳定的物质如酶是十分有利的。这种电泳还可作预电泳，把聚合时残留的催化剂除去，以免样品被氧化而失活。当然这种体系的分离效果不如多相体系，但对比较简单的混合物，就可分离得很好。
复杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用多相缓冲体系； 如凝胶采用Tris-HC1缓冲液，电极槽采用Tris-甘氨酸缓冲液，所以有不同的负离子。同时凝胶柱的不同部分可用不同孔径的胶和用不同的pH缓冲液，它们的凝胶层、缓冲液离子、pH以及电位梯度都是不连续的。圆盘电泳是不连续性 (Discontinuity) 的，其前四个字母正是圆盘(Disc)之意，且电泳后区带也正好是圆盘状。样品的实际分离在分离胶（小孔径胶），但在分离胶之上有积层胶(或称间隔胶，大孔径胶)，样品组成在此处积层为很薄的带，这是因为样品分子在大孔胶中阻力小移动快，进到小孔径胶时阻力大速度减慢； 由于凝胶的不连续性，样品在界面处被浓缩。聚丙烯酰胺多相缓冲体系对分析生物高分子具有很高的分辨力，可作制备用，但更常是作分析用。凝胶电泳分离作用是按被分离分子的大小与电荷不同而完成。如果被测分子的分子电荷密度相同（如核酸），可比较简便地测定它们的分子量。对分子电荷密度不相同的物质，可以将其电荷作用消除，然后进行分子量测量，常用方法是用大量电荷配体如十二烷基硫酸钠(SDS)结合到蛋白质上，掩盖了蛋白质本身的电荷作用，而SDS的结合量约每克蛋白质1.4g，因而带有大约与分子大小恒定的电荷，从而电泳行为与分子大小相关。也可在不同浓度凝胶下测出迁移率，经数学处理除去电荷而求得分子量。
琼脂糖电泳 琼脂是多聚糖，主要由琼脂糖(约占70～80%) 和琼脂胶组成。琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水半乳糖交替聚合而成，而琼脂胶是含硫酸根和羧基的多糖，可以电渗利害且可吸附蛋白质，但琼脂糖凝胶则无缺点。琼脂糖凝胶制备比较简便，结构均匀，可制大孔径的胶，利于分离特别大的分子如病毒、核酸、脂蛋白及一些膜蛋白，尤其用于DNA的分析测定。电泳所需DNA样品仅0.5～1μg，甚而更少亦可。电泳后用溴乙啶染色，在254nm波长紫外光照射下呈橙黄色荧光，检测DNA十分灵敏。琼脂糖凝胶另一主要应用是免疫电泳。抗原和抗体在琼脂胶中扩散，当抗原分子与其抗体分子接触就产生沉淀线。通常免疫电泳是先把抗原样品血清在琼脂胶板上电泳分离，然后与电泳方向平行的一条槽内加入抗血清，抗原抗体都扩散即双向免疫扩散，而形成沉淀线。另有对流免疫电泳，也是以琼脂胶作支持物，在碱性缓冲液(>pH8.4)中，样品带负电荷，由阴极向正极泳动，而抗体接近其等电点，可因电渗作用由阳极向阴极移动，两者可在短时间内相遇而成沉淀线。还有单向定量免疫电泳或称火箭电泳。该方法是在琼脂胶板加入适宜的抗体，抗原就是在含适量抗体的琼脂中泳动。抗原与抗体相遇形成复合物而沉淀，由于电场作用，新的抗原加进沉淀中，沉淀因抗原过量而溶解，从而向前移动又形成新的沉淀。这样不断的沉淀-溶解-沉淀至全部抗原与抗体适量结合，短时间内出现锥形沉淀线，形似火箭。抗原含量越高火箭峰越长，按其长度与标准抗原形成者相比较就能精确计算出抗原的浓度。
淀粉胶电泳 淀粉是直链淀粉与支链淀粉的混合物。悬浮在缓冲液中的淀粉加热后冷却即成凝胶，可进行电泳。淀粉胶电泳分辨力很好，仅次于聚丙烯酰胺电泳，远强于纸电泳。不过淀粉是天然物质，其组成变化很大，直链淀粉与支链淀粉的比例也不相同，所以其成胶能力和分离作用差别很大。因此对每批淀粉都要作初步实验以求得最合适的浓度等条件，不同浓度的淀粉可产生不同稠度和孔径的凝胶，但重复出同样性状的淀粉胶是十分困难的。再者淀粉胶没有聚丙烯酰胺和琼脂糖的透明度，作光密度测定就不易准确。由于这些原因，淀粉胶电泳的应用已见少。
纸电泳 过去多用来分离蛋白质和其他大分子，但其孔径不均一以及吸附蛋白质，所以分辨力差，例如血清蛋白质通常只能分出5条带，而象聚丙烯酰胺电泳则可分出20～30条区带。目前纸电泳多应用于氨基酸、肽和核苷酸的分析，且多采高电压。醋酸纤维膜具有比滤纸较均一的孔径，且对蛋白质的吸附作用较滤纸轻，所以蛋白质带不拖尾，分辨较高。硅胶和纤维素也可铺成薄板作电泳，凡在滤纸上可行的也可作薄层电泳。用它们较均一，分辨力较高。