蛋白质的测定——微量凯氏定氮法(GB／T　14771—1993)

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1．原理

利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。将消化液碱化、蒸馏，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用盐酸标准溶液滴定所生成的硼酸铵，由所消耗的盐酸标准液的量，乘以换算系数，即可计算出蛋白质的含量。

本法适用于各类食品中蛋白质的测定。

2．试剂

(1)硫酸铜。

(2)硫酸钾。

(3)硫酸。

(4)4%硼酸溶液。

(5)混合指示剂：1份0．1%次甲基蓝乙醇溶液与2份0．1%甲基红乙醇溶液临用时混合。

(6)40%氢氧化钠溶液。

(7)0．1mol／L盐酸标准溶液。

3．仪器

微量定氮仪(如图4－2－1)。

图4－2－1 微量定氮仪

1－电炉 2－水蒸气发生瓶 3－螺旋夹 4－小玻杯及玻璃塞 5－反应室 6－反应室外层 7－橡皮管 8－冷凝管 9－蒸馏液接收瓶

4．操作方法

(1)样品处理：精密称取0．5～5．0g固体样品或2～5g半固体(精确称至0．001g)或吸取10～20mL液体样品(相当于氮30～40mg)，移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中，避免黏附在瓶壁上，加入0．4g硫酸铜、10g硫酸钾及20mL硫酸及数粒玻璃珠，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再连续加热0．5h。取下放冷，小心加水20mL。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗凯氏烧瓶，洗涤液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸做试剂空白试验。

(2)按图4－2－1装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2／3处，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃球以防爆沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

(3)向接收瓶内加入10mL 4%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入接受瓶的液面下，吸取10．0mL样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室，并以10mL水洗涤小玻杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞。将10mL 40%氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸汽通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。洗液并入接收瓶中，取下接收瓶，以0．1mol／L盐酸标准液滴定收集液至刚出现紫红色为终点。

同一试样做两次平行试验，同时吸取10．0mL试剂空白消化液做试剂空白。

5．计算

式中 x——样品中蛋白质的含量(%)；

V₁——样品消耗盐酸标准溶液的体积(mL)；

V₂——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积(mL)；

c——盐酸标准溶液的量浓度(mol／L)；

0．014——1mol／L盐酸标准溶液1mL相当于氮的克数；

m——样品的质量(体积)［g(mL)］；

F——氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15%～17%，按16%计算乘以6．25即为蛋白质，乳制品为6．38；面粉为5．70；玉米、高粱为6．24；花生为5．46；米为5．95；大豆及其制品为5．71；肉与肉制品为6．25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5．83；芝麻、向日葵为5．30。计算结果精确至小数点后第二位。

6．注意事项

(1)消化如不易得到澄清透明的溶液，可将定氮瓶放冷后，缓缓加30%过氧化氢2～3mL，促进氧化。

(2)如取样量大，干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。

(3)若样品含脂肪或糖较多时，消化时易产生大量泡沫并外溢，可加入少量辛醇或液体石蜡消泡。

(4)所用试剂应用无氨水配制。用甲基红指示剂，调节蒸馏水发生器中的水为酸性后，蒸馏出即为无氨蒸馏水。

(5)蒸馏操作加入氢氧化钠溶液前，一定要将整个装置的连接密封好，以免氨逸出。使结果偏低。

(6)硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。

(7)蒸馏完毕，应先将锥形瓶下降，使馏出管尖端离开液面，然后再撤离热源，以免倒吸。

7．允许差

同一样品两次测定值之差，当蛋白质含量小于1%时，不得超过平均值的10%；当蛋白质含量大于1%时，每100g样品不得超过0．5g。