物理消毒灭菌法

用于消毒灭菌的物理学方法主要有热力灭菌法、电磁波射线杀菌、超声波杀菌和滤过除菌法。
热力灭菌法 高温对微生物有明显的致死作用。细菌对高温的抵抗力，视其种类、发育阶段及有无芽胞而异。大多无芽胞菌在55～60℃液体中经30～60分钟后死亡，100℃时迅速杀灭。细菌的芽胞对高热有很强抵抗力，例如炭疽杆菌芽胞，可耐受5～15分钟煮沸，破伤风杆菌和肉毒杆菌的芽胞则需3小时才死亡。芽胞抗热作用强，是因其含水量较少，蛋白质不易凝固； 且具有厚膜，热力不易透入。测定热力杀菌的效力，有两种方式表示：
❶热毙点： 指一定时间内杀菌所需的温度；
❷热毙时，指一定温度下杀菌所需的时间。热力灭菌法分湿热灭菌和干热灭菌两大类。在同一温度下，前者效力比后者为大，原因有三：
❶湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固。因蛋白质含水量增加，所需凝固的温度降低(表1)。
❷湿热的穿透力比干热大。一大卷布放在干烤箱内经数小时后，布的外面甚至烧焦，而内部尚未达所需温度。湿热灭菌时则不同，布卷内外温度接近 (表2)。
❸湿热的蒸汽有潜热存在。每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出539卡的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度。

表1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系

卵白蛋白含水量(%)	30分钟内凝固所需温度(℃)
50 25 18 6 0	56 74～80 80～90 145 160～170

表2 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较

	温度(℃)	时间（小时）	温度(℃)			灭菌
			20层	40层	100层
干热 湿热	130～140 105.3	4 3	86 101	72 101	70.5 101	不完全 完全

干热灭菌法 一般细菌的繁殖体，在干燥状态80～100℃经1小时可被杀死。芽胞则需160℃，经2小时才能杀灭。
❶焚烧： 是一种彻底的灭菌方法，但仅用于废弃污染物品或耐烧器皿。例如将被菌污染的纸张、传染性动物的尸体等予以烧毁，微生物学实验用的接种环、试管口等可在火焰上烧灼灭菌。
❷热空气（干烤）: 利用干烤箱，使温度增高至100℃以上。玻璃器皿、瓷器或需要干烤的注射器等都用此法。一般加热至160℃～170℃经2小时。这样，包括细菌芽胞在内的所有微生物均可被杀灭。
湿热灭菌法 常用的有以下数种：
❶巴氏消毒法： 应用较低温度达杀灭液体物质中的病原菌或特定微生物，而仍保持物品中的所需不耐热物质的消毒方法。因首先由Pasteur创用以消毒酒类，故名。目前还用于牛乳等的消毒。方法有两种： 一是61.1～62.8℃半小时； 另一是71.7℃经15～30秒种，今广泛使用后法。
❷煮沸法：在一个大气压下，水的沸点是100℃。刀、剪、注射器等，可行煮沸灭菌。一般细菌繁殖体，煮沸5分钟即被杀死；至于芽胞，则需1～2小时。水中加入1～2%碳酸氢钠，可提高其沸点达105℃。既可促进芽胞的杀灭，又可防止金属器皿生锈。
❸流通蒸汽灭菌法： 流通蒸汽的温度，一般不超过100℃。Arnold流通蒸汽灭菌器为本法的常用器具，我国的蒸笼亦可用来进行流通蒸汽灭菌。细菌繁殖体在流通蒸汽下经15～30分钟即可杀死，但芽胞常不全部被杀灭。
❹间歇灭菌法：有些物质加热至100℃以上将被破坏，例如血清培养基。欲杀灭这类物质中的细菌芽胞而仍保持其原有生物学性能，则须用此法。置物于Arnold灭菌器，经15～30分钟，每日一次，连续3日。第一次灭菌后，物体上的细菌繁殖体已被杀灭，但芽胞未被全杀。取出后放37℃温箱过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再灭菌，则由芽胞发育成的繁殖体可被杀灭。一般经如此3次后，物体上的芽胞尽被杀死。若有的物质不耐100℃，则可将温度降至75～80℃，每次加热时间延长至30～60分钟，并次数增多(3次以上)，也可达到灭菌目的。例如使用血清凝固器行鸡卵培养基或血清培养基的灭菌即属之。
❺高压蒸汽灭菌法： 是一种最有效的灭菌方法。系将蒸锅密封紧闭，使其中蒸汽不外溢。锅内蒸汽增多，压力增高，蒸汽的温度也随之增高，杀菌效力大为加强。通常在1.05kg/cm2(15 1bs/in2)蒸汽压下，温度达121.3℃，维持15～20分钟，可杀死所有微生物（包括细菌芽胞）。此法适用于耐高温、耐水物品的消毒灭菌，如普通培养基、生理盐水、耐热药品、敷料等。用于高压蒸汽灭菌的蒸锅称为高压蒸汽灭菌器。电磁波射线杀菌 电磁波射线除可被一些能产色素的细菌利用为能源外，对一般菌多少有害。可见光的波长在4.000～8.000间， 这段波对一般菌作用不大。 在紫外光波段中肉眼不可见的射线杀菌作用强。波长较长的红外线杀菌作用，主要是由于它产生的高热。
电磁辐射 包括高速电子、X线和γ线等。在足够剂量时，对各种细胞包括细菌均有致死作用。其作用机理在于产生游离基，破坏DNA。电磁辐射可用于不耐热的塑料制品等消毒。
日光和紫外线 日光杀菌的主要成分是紫外线。紫外线波长2,000～3,000者，具有杀菌作用，其中以2,650～2, 660杀菌力最强。 紫外线杀菌机理还不十分清楚。已经证明，引起细菌变异或致死的紫外线波长在2,600左右，而核酸最大吸收率也在此波长附近，表明核酸可能吸收紫外线而改变其生物学活性，因而导致细菌等死亡或变异。有人认为紫外线的照射可引起DNA中的胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰了DNA的复制。紫外线可用于消毒空气、不耐热或化学物质的器械 (高速离心器的塑料管、纤维薄膜等)，以及变异研究等。
光感作用 将某些染料加入细菌、病毒、原虫、毒素或酶等中，可增强其对可见光的敏感性，此称为光感作用。例如美蓝的光感作用可加速破坏葡萄球菌噬菌体和葡萄球菌毒素的毒性，但仍保持其抗原性； 破坏抗体蛋白质的结构等。革兰阳性菌对光感作用比革兰阴性菌敏感。伊红、红汞、美蓝只对革兰阳性菌有作用，沙黄只对革兰阴性菌有作用。光感作用机理尚未全明。可能是在有氧、染料与可见光存在的条件下，某种生物学的重要分子被氧化的过程。这种损伤可为类胡萝卜素色素所抵消，这可部分解释为何空气及海水中的细菌大多能产色素。亦可能氧激活染料所形成的氧化产物起杀菌作用所致。
激光 激光是从激光器射出的一束极细且平行的光波。能量高度集中，在千分之几秒甚至更短时间内能使物质熔解或气化。也可在百分之几mm内产生百万度级的高温，几百万个大气压，每cm几千万伏特的强电场。有人建议可试用于医疗器械、空气以及创面的消毒，但应首先解决如何使光速能达到被消毒物品的每一部分这一技术问题。
超声波杀菌 人耳能听见的声波频率为20～20,000赫兹(Hz)，高于20,000Hz者称超声波。频率较高的可闻声波和超声波(9,000～100,000Hz)可使大多菌裂解。声波的杀菌作用，振幅比频率更重要，即低频高强度的声波比高频低强度的声波效强。超声波亦可杀灭脊髓灰质炎、脑炎、狂犬病、天花等病毒，但对大肠杆菌噬菌体、肝炎病毒等无作用。2,000,000Hz的声波能使水中的热原质丧失活性，可试用于制造无热原质的蒸馏水。超声波的杀菌机理在于其通过水时发生的空腔化作用。当声波在液体中造成了压力改变，应力薄弱区就形成许多小空腔。起初仅10μm大，以后逐渐增大，最后崩破。崩破时压力可达1,000个大气压，因而引起细菌的裂解。同时，空腔化作用还能破坏原生质的胶体状态与细菌的酶：并能使溶解于液体中的氧变为H₂O₂，通过后者的氧化作用而杀菌。
滤过除菌法 滤过除菌法是用机械方法将液体或空气中的细菌除去的一种物理方法。所用的器具是滤菌器。滤菌器含有微细小孔，只允许液体或气体通过，大于孔径的物体不能通过，借以获得无菌液体或空气。主要用于一些不耐高温灭菌的血清、毒素、抗生素、药液、空气等除菌。滤菌器一般不能除去病毒、支原体和细菌L型等。滤菌器种类很多，常用的有：
❶Chamberland滤菌器： 是用未上釉的陶瓷制成的空心圆柱体，其一端开口。被滤液体灌入柱心，因抽气负压作用使液体渗过柱壁流至柱外。按滤孔大小分为L₁、L₁ bis、L₂、L₃、L₅、L₇、L₉、L₁₁及L₁₃9级。L₁孔最大，细菌能通过； L₃以后滤孔较小，细菌不能通过。
❷Berkefeld滤菌器：是用硅藻土加压制成的空心圆柱体。底部连接在金属托板上，其中央装有金属管导出于圆柱外。圆柱体外装有玻璃套筒，盛放被滤液体。按滤孔大小，分为V、N及W三种。V孔最大，与Chamberland滤菌器L₁相当，N及W则与其L₃及L₁₃相当。
❸Seitz滤菌器： 是用金属制成，中嵌以石棉滤板。滤孔分三等，K最大，澄清用； EK较小，常用以去除一般细菌； EK-S最小，可阻止大病毒通过。
❹玻璃滤菌器： 全由玻璃制成，滤菌板系用玻璃细砂在一定温度下压成小碟，镶嵌在玻璃漏斗中。一般分G₁～G₅六种，后二种(G₅、G₆)均能阻止细菌通过。市售的G₅/3型为G₅滤板加固在G₃滤板上制成。
❺薄膜滤菌器： 由醋酸纤维制成薄膜，厚度仅0.1mm，装在一个不锈钢支架上。薄膜滤孔的大小为0.05～14μm，常用于除菌的为0.22μm。醋酸纤维薄膜的优点是本身不带电荷，故当液体滤过后，其中有效成份丧失较少。现代手术室、烧伤病房以及实验室无菌操作时应用的高效微粒滤菌器 (highefficiency particulate air filter,HEPA filter)，亦由醋酸纤维制成，借此可去除空气中直径0.3μm微粒的效率达99.97%。滤器可根据工作需要设计，一般采用空气层流方式。例如手术室的一侧墙壁装有滤器，空气自该侧流入，向对侧墙壁流出，以保持室内空气的无菌。在微生物实验操作时的超净工作台，其原理与此相同。空气流动途径以通过滤器由台顶向下经台面小孔流出为佳； 若空气由内向外流通，虽亦可保持操作过程中无空气中杂菌的进入，但有将实验微生物感染工作人员的危险。