核素衍生物法

核素衍生物法是用放射性标记试剂同被分析样品进行化学反应，使被测物转变为核素标记的衍生物，由衍生物的放射性计算出样品中被测物的含量。这是使有机化学中的衍生物方法与核素稀释法原理相结合的一种微量分析技术，它可以克服用核素稀释法直接测定生物材料中微量物质有时存在的困难。
原理 设样品中被测物同放射性标记试剂起定量化学反应，
S_r为试剂的比放射性(dpm/m mole)
C_D为衍生物的放射性(dpm)
W_u为被测物的含量(m mole)
N为与一个被测物分子起反应所需标记试剂的分子数
则

反应后，分离出衍生物并测量CD值。此为简单衍生物法，要求定量反应和定量回收，但一般不易做到。

图1 单标记衍生物稀释法示意
1. 测定物 2. 定量衍生物反应
3. 标记衍生物 4. 加入一定量
非标记衍生物 5. 标记衍生物
6. 分离提纯 7. 提纯样品 8.
测量放射性 9. 测定化学量

若于反应后加入非标记的相同衍生物进行反稀释，用化学量校正操作中的丢失，即为单标记衍生物法。
设W_uL为加入非标记衍生物的量(m mole)S₁为提纯后衍生物的比放射性(dpm/m mole)

单标记衍生物法要求定量反应但不要求定量回收。为求出比放射性S₁，反应衍生物应分离到一定化学纯度及放射化学纯度并测定其化学量。
若于反应前加入被测物的标记示踪物，用放射性校正操作中的丢失，则称为双标记衍生物法。

图2 双标记衍生物法（完全指示剂技术）示意
1. 测定物 2. 加入示踪物 3. 测定物 4. 衍生物
反应 5.双标记衍生物 6.分离提纯 7.提纯样
品 8. 测量两种放射性

设W₀为标记示踪物的量(m mole)
S₀为标记示踪物的比放射性(dpm/m mole)
S_r为标记试剂的比放射性(dpm/m mole)
C₁为提纯样品中来自示踪物的放射性(dpm)
C₂为提纯样品中来自反应试剂的放射性(dpm)
W_u为被测物含量(m mole)
Cr为在定量反应情况下来自试剂的放射性(dpm)
N为一个被测物分子起反应所需反应试剂分子数

操作中被测物丢失的校正因子为

当N=1时

上式中不包括C_r项，故双标记衍生物法不要求定量反应和定量回收。当样品中的被测物不能直接同标记试剂起反应时，可将被测物先转变为适当的衍生物，使所得衍生物再与标记试剂进行反应。两次衍生物反应中的丢失仍可得到校正。

图3 双标记衍生物法 (部分指
示剂技术)示意
1. 测定物 2. 定量衍生物反应
3. 标记衍生物 4. 加入不同标
记的衍生物 5. 双标记衍生物
6. 分离提纯 7. 提纯样品 8.
测量两种放射性

当不能得到被测物的适当标记物时，可在反应后加入另一种核素标记的相同衍生物（可标记在试剂部分或被测物部分）作指示剂，校正反应以后操作过程的丢失。因此要求定量反应但不要求定量回收。
设C₁为提纯样品中来自指示剂的放射性(dpm)C₂为提纯样品中来自反应试剂的放射性

双标记衍生物法不要求测定化学量。在不影响放射性测量的情况下，一般不要求化学纯度，只要求放射化学纯度。因此可加入非放射性载体促进提纯，或用反载体法将放射性杂质“洗出”。
核素衍生物法包括标记物制备，样品初步提纯，衍生物制备、分离和测量放射性。标记物包括反应试剂和示踪剂两类。所用核素有³H、¹⁴C 、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I。应用最多的为¹⁴C及³H。标记物应有高比放射性(20mCi/mmole的¹⁴C化合物最低可测10^-9g,1Ci/m mole的³H化合物为10^-10g)。标记部位应稳定并达到一定的化学及放射化学纯度。衍生物制备有化学法及酶促法两类。常用的标记试剂及其化学反应见表。反应前应将样品中的被测物初步纯化和浓缩。反应后将过剩的反应试剂及其他放射性杂质去除。分离提纯多采用溶剂抽提或层析分离等生化方法。当被测物为某种酶的底物时，可在分析样品中加入被测物的示踪物作为指示剂，同时加入第二种核素标记的辅助因子，和酶一同保温，然后分离和测量酶反应产物的放射性。双标记衍生物技术中，要求测量两种放射性(见“多标记测量”条)。
应用 核素衍生物法早期多用于测定氨基酸类物质，用¹³¹I或³⁵S标记反应试剂，比放射性较低，测定灵敏度为微克水平。随着氚的广泛应用和标记技术的改进，核素衍生物法得到一定的发展。用于测定生物材料中的类固醇，使测定灵敏度达到了10^-9g水平。此外，还用于测定生物碱、抗生素及糖类等物质（见表）。近年来迅速发展起来的竞争放射分析法不必进行繁杂的化学操作和双标记测量，比核素衍生物法有着更多的优点。因此，核素衍生物法目前只用于测定尚未建立起更简便可靠方法的某些物质，以及用于对某项新的放射分析技术的灵敏度和特异性作出对比评价。

核素衍生物法常用标记试剂及其反应

反应基团	放射性试剂	测 定 物
—NH2	对-碘苯磺酰氯-131I (或35S)	氨基酸，嘧啶核碱
	乙酸酐-3H(或14C)	氨基酸，含碘氨基酸，胺类 药物
	2,4-二硝基氟苯-2H 异硫氰酸苯酯-35S 苄氧羰酰氯-14C	氨基酸 蛋白质-N-末端 L-氨基酸光学纯度
—OH	对-碘苯磺酰氯-35S 对-碘苯磺酰酐-35S	雌酮，17β-雌二醇 皮质醇，皮质酮，11-脱氧 皮质酮，17-羟皮质酮， 醛固酮
	对-碘苯甲酰氯-131I 硫酸二甲酯-3H 乙酸酐-3H(或14C)	二氢胆固醇，胆固醇 雌二醇，雌酮 醛固酮，氢皮质酮，皮质酮， 皮质醇，睾丸酮，雌酮， 脱氢表雄酮，雄烯二酮， 孕酮，20α-氢孕-4-烯- 3-酮，5α-胆固烷-3β- 醇，雌二醇，4-羟-3-甲 氧基苦杏仁酸，cAMP
>C=O	氨基硫脲-35S	睾丸酮，孕酮，雄烯二酮
—CHO	氰化钠-14C 对碘苯肼-131I	糖，多糖 邻（或间）-硝基苯甲醛
—COOH	重氮甲烷-14C	氨基酸，赤霉酸，游离脂肪 酸
	64Cu离子 乙酸酐-3H 对碘苯胺-131I	α-氨基酸 蛋白质C-末端氨基酸 乙酸，丙酸
—SH	氯汞苯甲酸-14C 四乙基秋兰姆-35S 14C-N-乙基马来酰亚 胺	酶蛋白-SH基 蛋白质-SH基 蛋白质-SH基
其他	硼氢化钠-2H 82B1 四唑盐-14C	孕酮 雌酮，雌二醇 皮质类固醇