高效液相色谱法

简称“HPLC”。从柱色谱法发展而来的一种新型分析方法，基本原理与柱色谱相似。高效液相色谱仪使用密封的管柱，采用泵加压促使溶剂在柱中快速流动。为了达到加压效果，色谱柱中的担体直径较柱色谱小得多，分析速度较柱色谱快100倍。该仪器还备有控制和显示压力的部件，以及放在末端的检录从柱中馏出组分的探测器等。检测器记录的信号经放大后转化为液相色谱图。高效液相色谱法广泛应用于复杂有机物质的分析，在刑事化验中常用于检验药物和爆炸物等物证。

高效液相色谱法high performance liquidchromatography

又称高压液相色谱法或高速液相色谱法。简称HPLC。
高效液相色谱法是在经典液相色谱基础上发展起来的新型分离分析技术。流动相为液相的色谱法称为液相色谱法。被分析物质随流动相移动，同时在流动相与固定相两相间进行反复多次分配，不同物质由于在两相中的分配系数不同，因而移动速度不同，最终彼此分离。也可利用不同物质不同的吸附、渗透或离子交换能力进行分离。经典的液相色谱由于分离效率低、分析时间长、检测方法麻烦等问题，应用不广泛。20世纪50年代，气相色谱的出现，使色谱分析的理论与技术有了很大的发展。60年代末期，研制出了适合于液相色谱的高效固定相、高灵敏度检测器和高压泵等，使液相色谱技术有了突破，大大提高了分析速度和分离效率，并实现了仪器化。为了与经典的液相色谱相区别，称这种新型的液相色谱为高效液相色谱。高效液相色谱法的基本流程如下图所示。

高效液相色谱流程图

1.贮液瓶；2.过滤净化器；3.输液泵；4.混合器；5.梯度洗脱备用装置；6.压力表；7.进样阀；8.分离注；9.控温箱；10.检测器；11.记录仪；12.组分收集器

仪器 使用的仪器为高效液相色谱仪，主要由高压泵及输液系统、色谱柱和检测器等部件组成。
高压泵及输液系统 该系统的作用是保证流动相正常工作，它由贮液瓶、脱气装置、高压泵、程序控制器（即梯度装置）及阻尼装置等组成。高压泵应有较高的输出压力和较大的流量调节范围，应使流动相（洗脱液）液流恒定、无脉动。高压泵的种类有机械注射泵、机械往复泵、气动放大泵等。在泵后装上阻尼装置可得到更平滑的流量。程序控制器的作用是进行梯度洗脱，即在分离过程中按一定的程序连续改变流动相的组成，梯度洗脱可提高分离效率和加快分析速度。脱气装置的作用是在洗脱液中通入氮气或氦气，除去洗脱液中的气体，防止气体对检测带来影响。
色谱柱 是直接关系到分离效果好坏的核心部件。一般采用内径2～5毫米的不锈钢柱，通常为直形，其长度为25～150厘米。柱接头要求密封耐压。为得到均匀填充床，管内壁需仔细抛光。也可采用玻璃柱，但耐压较低。作为固定相的柱内填充物为粒度很细的能承受高压的高效填料。常用的固定相有硅胶、氧化铝等吸附剂，涂于惰性担体上的难挥发液体、化学键结合物质、离子交换树脂、凝胶等。
检测器 用于检出柱流出物的成分。最常用的检测器有：❶紫外检测器。利用被测组分对紫外光的吸收进行检测，可分为固定波长和分光两种。
❷差示折光检测器。利用纯流动相和含有被分析组分的流动相之间折光率的差别进行检测，是一种通用型检测器。由于折光率随温度变化，检测器必须恒温。
❸荧光检测器。利用有些物质在紫外光照射下能发出荧光进行检测，有很高的灵敏度和选择性。此外，尚有电化学检测器、电导检测器、火焰离子化检测器、红外检测器、质谱检测器等。
特点 ❶分析对象广。适宜于分析气相色谱法无法分析的大量不易挥发性物质、热不稳定性物质及分子量在300以上的高分子类物质。因而在农业和生物学等领域里，许多活性物质(如生长素、昆虫激素等)以及高分子物质(蛋白质、核素、酶等)均可采用高效液相色谱法在常温下进行分离分析。
❷高效高速。由于采用了高压输液泵(压力可超过40 530千帕)及高效色谱柱（固定相粒度细至几个微米），分离效率高，分析速度可在几分钟至半小时左右完成。采用梯度洗脱程序可进一步提高分离效率，可分离结构稍有差异的同系物或异构体。
❸定性方便。可通过与光谱及质谱联用，在仪器上直接定性；也可通过组分收集器，将收集到的各组分在其他仪器上定性。
❹选择余地大。可针对不同的分析物质，选择不同的流动相、固定相和检测器，以求得最佳的分离分析效果。在液-液分配色谱中，可通过选择不同极性的流动相和固定相，来分析具有不同极性的化学物质。通常，使用极性固定相和非极性流动相的称为正相色谱，使用非极性固定相和极性流动相的称为反相色谱。
❺从总体上讲，其分离效果、检测器的检测范围及灵敏度等方面尚不及气相色谱。有时可采用化学衍生法弥补，即在色谱柱前或柱后与某种试剂在一定条件下进行化学反应，使反应的衍生物有利于分离与检测。
应用 高效液相色谱法在农业上有广泛的应用。可利用离子交换色谱分离分析氨基酸、维生素、核酸、生物碱、无机金属离子及阴离子等；利用液固吸附色谱、液液分配色谱分离分析核酸、维生素、糖类化合物、脂类化合物、类固醇、激素、黄曲霉素、香豆素、有机氯农药、有机磷农药、氨基甲酸酯农药及除草剂等；利用空间排斥色谱（凝胶渗透色谱）分离分析蛋白质等。

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高效液相色谱法high performance liquidchromatography,HPLC

以液体为流动相，液体或固体为固定相，由高效分离柱，高压输液泵和高灵敏度检测器组成的液相色谱法。(见彩图55)
简史 俄国植物学家茨维特(M.S.Tswett)于1906年首次使用柱层析进行了植物色素的分离，是液相色谱法中最古老的一种，近30年来发展成各种各样的色谱分离法，并成为分析化学的一个重要部分。❶经典液相色谱法：流动相由柱管上端靠自身重力向下流动，在柱下部出口处逐份收集流出液，再用其他方法进行测定，分析速度慢、效率低；
❷薄层色谱法：出现于40年代前后，操作方便，分析速度上有了改进，但重复性差、定量困难；
❸高效液相色谱法：60年代初吉迪丁斯(J.C.Gidelings)将气相色谱理论经修正后用于液相色谱，为其现代化奠定了基础。此后在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，发展为分析速度快、分离效率高和操作自动化的高效液相色谱。1971年亨利(R.A.Henry)等首先把它用于农药分析。
特点 高效液相色谱法较经典液相色谱法具有以下特点：❶高压。一般可达1.471×10⁷～2.942×10⁷帕(150～300千克/厘米²);
❷高速。分离速度由过去几小时或几天，提高到几分钟或几十分钟；
❸高效。通常柱效可达50000塔板/米以上，有时一根柱子可以分离100种以上组分；
❹高灵敏度。最小检出量可达10-11克，微升数量级的试样，就足以进行分析。高效液相色谱法，不受试样挥发性的限制，对高沸点、热稳定性差、分子量大(大于400)的有机物，只要能制成溶液均可进行分析。可检测对象占有机物总数的70%以上。
仪器结构 一般由贮液槽、高压泵、梯度洗脱装置、进样器、色谱柱、检测器、记录器等构成（见图）。

高压液相色谱仪典型结构示意图
(据《农药分析》，1988)

流动相由高压泵输送，样品由进样器送入，在色谱柱中进行分离，分离后的各组分依次经检测器检测，输出信号由记录器记录为色谱图。❶高压泵：用高压输送流动相的关键部件。应满足以下要求：流量恒定，无脉动，有较大的调节范围；抗溶剂腐蚀；有较高的输出压力；泵的死体积要小，以便于迅速更换溶剂和梯度洗脱。
❷梯度洗脱装置：是高压输液系统的组成部分之一。梯度洗脱，就是流动相中含有两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定顺序连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果、缩短分离时间，增加分辨能力，改善峰形，从而提高最小检出量。
❸进样器：是把分析样品送入色谱柱的部件。在高效液相色谱中进样方法有三种：注射器法；环阀法；万能阀法。
❹色谱柱：是将杂质和样品各组分进行分离的部件。是高效液相色谱仪最重要的部件，大都采用内径为1～6毫米内壁抛光的不锈钢管，长度一般15～50厘米。液相色谱法的装柱是一项技巧性很强的技术，装填质量对柱效影响显著。
❺检测器：是将样品各组分和其量的变化连续地转换为易测量信号的部件。一个理想的检测器应该具有灵敏度高、重现性好响应快、线性范围宽、应用范围广、对流量和温度的变化不敏感等特性。但目前还没有一种很理想的HPLC检测器。目前商品仪器中应用最广泛的检测器是紫外检测器(UV)、示差折光检测器(RI)、荧光检测器(FD)。
分类 高效液相色谱法可分为四类。
液—液分配色谱法 流动相和固定相都是液体的液相色谱法。样本组分在互不相溶的两种液相中分配系数不同，得以实现分离和分析。流动相和固定相为两种互不相溶的液体，两者之间有一个明显的分界面，流动相流经色谱柱时，很大面积上与固定相接触，流动相中的样品组分，在两相之间，很快进行平衡分配，由于它们在两相之间相对溶解度的差异，以不同速度流经色谱柱，从而得到分离。在液—液分配色谱中，根据流动相和固定相相 极性不同，又分为正相分配色谱和反相分配色谱。以强极性亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相称为正相分配色谱，反之称为反相分配色谱。液—液分配色谱所用固定相有两种：❶物理涂渍的固定相。常用的极性固定液为；β,β′-氧二丙腈、聚乙二醇等；非极性固定液为：正十八烷、异三十烷等。其缺点是因固定液的流失，很难长时间维持其化学性能。
❷化学键合固定相，即把固定液化学结合在载体表面上的固定相。其特点为：❶表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；
❷无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；
❸可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性；
❹有利于梯度洗脱，也有利于配用灵敏的检测器，能适应多种色谱体系，广泛用于各种样品的分离。液—液色谱流动相，系根据极性大小进行选择，常用流动相，按极性由大到小顺序排列如下：水、乙腈、甲醇、乙酸、乙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、苯、四氯化碳、正已烷。这种色谱的特点为：❶再现性能非常稳定；
❷分离适用性广，从非极性化合物到极性化合物，都可以作其分离对象；
❸能做高精度定量分析。
液—固吸附色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂的液相色谱法。样本中各组分因对固定相表面吸附作用的差异，得以分离和分析。色谱柱内充填固体吸附剂，利用吸附剂表面活性中心进行吸附，试样不进入固定相内部。流动相带着被测组分进入柱子时，吸附剂不仅对不同的组分具有不同的吸附力，而且对流动相分子也具有一定的吸附作用，在吸附剂表面各组分分子之间及各组分分子与流动相分子之间发生吸附竞争。保留值由这两种因素所决定。液—固色谱固定相（吸附剂）可分为极性和非极性两类。极性的为：硅胶、氧化铝、氧化镁、分子筛等；非极性的主要为活性炭，因机械稳定性差很少使用。液—固色谱流动相，系利用溶剂强度参数来选择适当极性的溶剂，常用溶剂按溶剂强度参数由小到大顺序排列为：异辛烷、四氯化碳、二甲苯、苯、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙腈、吡啶、乙醇、乙酸、水等。液—固吸附色谱法的特点为：❶适合可溶于有机溶剂的非离子型化合物的分离，特别是异构体及具有极性不同的取代基的化合物的分离；
❷吸附剂重复性差，故柱稳定性不好；
❸样品组分吸附在吸附剂之活性部位有变质和损失的可能。
离子交换色谱法 根据离子交换的原理进行分离的液相色谱法。基于作为固定相的离子交换剂（薄膜型离子交换树脂和离子交换键合固定相）上可电离的离子，与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依样品中不同组分的离子对交换剂具有不同的亲合力而将其分离。离子交换色谱法固定相，主要有以下类型：❶微粒树脂型；
❷表面多孔型；
❸硅胶键合相多孔微粒。❶～
❸骨架基体上可引入各种离子基团，或涂渍、键合有机离子交换剂。流动相多采用在水溶液中含有一定离子强度的缓冲液，或与水混溶的有机溶剂。如：甲醇、乙醇、乙腈、二氧六环等。离子交换色谱法特点为：❶多数情况对离子的分离有效，至少要部分离子化的化合物方可用此法；
❷除离子交换外，还可能有吸附和分配作用；
❸离子交换剂每批产品间性能不重复。
凝胶色谱法 依据分子大小顺序而分离的液相色谱法。用化学惰性的具有网状结构的多孔性物质作固定相，试样组分按分子大小构形进行分离。也称排阻色谱法，是四种液相色谱法中最新的一种。其作用近似于分子筛效应：试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙及凝胶孔穴旁流过，体积大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去，而较早地被淋洗出来。中等体积分子产生部分渗透作用。小分子可以渗透到孔穴里去，因此被较晚地冲洗出来，从而达到分离的目的。水或水溶液作流动相的凝胶色谱称为凝胶过滤色谱。以有机溶剂作流动相的凝胶色谱称为凝胶渗透色谱。凝胶色谱固定相有3种类型：❶软性凝胶。如网状交联多聚葡萄糖等；
❷半刚性凝胶。如交联聚苯乙烯等；
❸刚性凝胶。如多孔硅胶等。流动相为：水、缓冲盐溶液、乙醇、四氢呋喃、甲苯、间甲苯酚、N,N-二甲基甲酰胺等。凝胶色谱法特点为：❶适用于非离子型的高分子化合物，样品成分分子量差别愈大愈易分离；
❷可测聚合物的分子量分布；
❸是一种最稳定的分离手段，不会引起样品的变质和损失。
上述各种分离机理，既用于分析色谱，又用于制备色谱。制备色谱即制备纯物质的色谱技术，用以分离、收集一种或多种色谱纯组分，供定性鉴定，作色谱标样或用于合成等。它与分析色谱技术的重要区别是：色谱柱尺寸大、柱容量高、分离样品量高几个数量级。
应用 高效液相色谱法的定性定量分析原理与气相色谱法相同，但由于固定相和流动相都参予样品组分的分离，故分离效果更好，在农药原药、制剂和残留分析中的应用迅速发展，正成为农药实验室的重要分析手段。
分析中主要是应根据样品的性质，选择适当类型的色谱。任何一种液相色谱都有自己的特点和应用范围，适合于一定的分析对象。对复杂的混合物，有时需将不同类型的液相色谱法进行组合。一般可根据试样的分子量、极性、溶解度、分子结构、解离情况等特性选择分离方法。参见下表：

高效液相色谱法high performance liquid chromatography

即高压液相色谱法。

高效液相色谱法

高效液相色谱法又称高速液相色谱法，或高压液相色谱法。由经典液相柱色谱法发展而来。经典柱色谱法由于流动相在常压的柱中流动，柱效低，分析时间长。60年代末，由于色谱理论和仪器的发展，采用高压泵输送流动相，并使用窄范围的细颗粒固定相与各种检测器，使柱效和检测灵敏度大大提高，从根本上弥补了经典液相柱色谱的不足。
高效液相色谱法可分离除气体外的各种可溶性物质。对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离分析如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类酯、抗生素、合成药物等尤为适用。经典液相色谱与高效液相色谱的比较见下表。

经典液相色谱法与高效液相色谱法的比较

参数	经典法	高效法
填充剂颗粒大小(μm) 颗粒大小分布范围(%) 柱长(cm) 直径(cm) 柱入口压(atm) 柱效，理论塔板数 样品量(g) 分析时间(h)	75～600 20～30 10～100 1～5 0.01～1.0 2～50 1～10 1～20	3～20 <5 5～50 0.1～1.0 20～300 103～104 10-6～10-2 0.05～1

根据分离过程的机理，高效液相色谱法可分为四种类型：
❶吸附色谱（液固色谱）;
❷分配色谱（液液色谱）;
❸离子交换色谱；
❹排阻色谱（凝胶色谱）。
所用仪器称高效液相色谱仪，由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等组成。色谱柱内填充窄范围的细颗粒(常用者有3、5、10μm)吸附剂或其他固定相。现在应用较多的是反相色谱法，以在硅胶上键合了十八碳烷基或其他烃基的键合相为固定相，以水-甲醇或水-乙腈等亲水性溶剂为流动相。
样品从色谱柱顶端注入，由加压的流动相洗脱出各组分依次通过检测器，产生与浓度相应的信号，然后放大输至记录仪，或经数据处理机将结果处理。本法具有快速、分离效能高、检出灵敏度高及自动化等特点。目前在化学及其他领域已成为一种十分有效的分离与分析手段。
本法仍在不断发展中，如使用更细的色谱柱，与质谱计、核磁共振仪、付里叶转换红外光谱仪联用等。