家畜布氏杆菌病补体结合反应操作技术

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(一)材料准备

1．溶血素：由兽医生物药品厂生产供应，按说明书使用。

2．抗原：由兽医生物药品厂生产供应，按说明书使用。

3．补体：选择壮龄健康豚鼠3－5只，绝食6－8小时后，于使用前一日从心脏采血，分离血清后混合保存于普通冰箱中，也可以用冻干补体，冻干补体于试验前一日加生理盐水恢复原状后使用。

4．红细胞悬液：采取成年公绵羊血液，按常规方法脱纤，洗涤，离心，用生理盐水洗涤3－4次，最后一次以2000转／分，离心沉淀10分钟，除去上清液取下沉红细胞泥，以生理盐水配制成2．5%红细胞悬液。

5．血清：

阳性血清和阴性血清：由兽医生物药品厂生产供应，按说明书使用。

被检血清：用常规方法采血，分离血清。

所用血清用生理盐水作1∶10稀释，按表一规定在水浴箱中灭能。

表2－4 各种动物的被检血清灭能的温度和时间

(二)预备试验

进行正式试验之前，须先对各种成份进行滴定，滴定方法如下：

1．溶血素效价滴定：加等量甘油防腐的溶血素取0．2毫升加生理盐水9．8毫升配制成1∶100基础稀释液。按表2－5方法作进一步稀释。再按表2－6方法加入各种成份进行溶血素效价滴定。滴定过效价的溶血素，在2－3月内可按滴定的效价继续使用，不必重测。

表2－5 溶血素稀释法

表2－6 溶血素效价滴定表

注：从水浴中取出，立即判定结果。

溶血素的效价：用1∶20补体0．5毫升在37－38℃水浴箱中20分钟，能使2．5%红细胞0．5毫升完全溶血的最少量溶血素，即为溶血素效价(滴定效价)，或溶血素一单位。照上表结果对照管均不溶血，1－6管完全溶血，故溶血素滴定效价为3600倍(第6管)。

正式试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量，即二单位。依表2－6滴定，溶血素的工作效价应为1500倍。

2．补体效价滴定：每次进行补体结合试验，应于当日测定补体效价。以生理盐水配制1∶20补体稀释液和一个工作量抗原，按表2－7滴定补体效价。

表2－7 补体效价测定

加热完毕，取出观察，按表2－9所举的范例记录结果。以溶血百分数作判定，依据溶血百分数的配制见正式试验表2－11。

表2-9 布氏杆菌补体结合抗原效价滴定结果(举例)

表2-11 标准比色管配制方贰反应判定标准

抗原对阴性血清应完全溶血。对两份阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度，而为抗原效价。但实际应用时，抗原的稀释度应比测定的效价浓25%。在本例中效价为1∶150，实际应用时作1∶112．5稀释使用，如效价为1∶100，则作1∶75稀释使用。

补体效价：是指在二单位溶血素存在的情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需最小补体量，就是所测得的补体效价。如表2－7中的第6管20倍稀释的补体0．25毫升即为工作量补体。按下式计算，原补体在使用时应稀释的倍数。

即此例补体应作1∶40稀释，每管加0．5毫升，此即为一个补体单位，考虑到补体性质极不稳定，在操作过程中效价会降低，故使用浓度比原效价大10%左右，因此，本批补体应作1∶36稀释使用，每管0．5毫升。

3．抗原效价滴定：抗原一般按照出厂说明书使用，但初次使用或因保存过久等其他原因需要滴定时可按下法进行滴定。

滴定抗原须用二份阳性血清(即一份强阳性血清和一份弱阳性血清)和一份阴性血清。

抗原：用生理盐水将抗原稀释成1∶10、1∶50、1∶75、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400和1∶500等稀释液。

阳性血清：用生理盐水将灭能过的阳性血清稀释成1∶25、1∶50、1∶75和1∶100等稀释液。

阴性血清：阴性血清用生理盐水作1∶10稀释液。

补体：配制成一个工作量的补体稀释液。

溶血素：配制成二个单位溶血素稀释液。

红细胞悬液：2．5%公绵羊红细胞悬液。

然后按表2－8进行棋盘式滴定。

表2－8 布氏杆菌补体结合抗原效价滴定程序表

(三)正式试验 各种主要成份经过滴定后，即可进行被检血清的正式试验。

正式试验中各种成份的配制与预备试验同。

正式试验按表2－10进行。

表2－10 布氏杆菌补体结合反应正式试验

每次试验时，各列对照管只需做一组。

各试验管加温完毕后取出立即进行第1次判定。要求不加抗原的阳性血清对照管，不加抗原和加抗原的阴性血清对照，抗原对照管呈完全溶血反应，静置12小时后作第2次判定，第2次判定时要求溶血素对照管，补体对照管呈完全抑制溶血反应，若反应正确即可对被检血清进行判定，被检血清不加抗原管应为完全溶血，被检血清加抗原管的判定按表2－11记录结果。

牛、羊、猪血清补体结合反应判定标准均相同。