细菌DNA的提取

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(一)细菌的培养

待测细菌一般采用液体培养，在摇床上振荡培养，此法细菌生长快，菌体收获多，离心收集容易，也可采用固体培养法，待细菌大量生长后，用生理盐水洗下菌苔，一般收获2～3g湿菌体足够做DNA提取用。

(二)菌体的裂解

菌体裂解是提取DNA成功的关键步骤之一，一般革兰氏阴性细菌和某些革兰氏阳性细菌在2%SDS溶液中60℃处理15分钟，可使菌体裂解。裂解后可观察到菌悬液变清和粘度增加，溶解革兰氏阳性菌最有效的方法是在40%溶菌酶条件下37℃处理1小时，然后再加入2%SDS60℃处理10分钟。

(三)菌体DNA的提取

提取DNA的方法很多，并各有所长(表3－1)。一般采用氯仿苯酚混合提取法。每克湿菌体可得1～2mgDNA，相当总量的50%。蛋白质污染一般在2%以下，DNA对紫外线的最高吸收峰接近260nm，其吸光度的典型比率260∶230∶280nm是1∶0．450∶0．515。

表3－1 提取细菌DNA的方法

(四)DNA的保存

高分子量(1mg)1ml的DNA溶解在1SSC或0．1SSC溶液中，加入几滴氯仿作为防腐剂，在4℃下可保存几个月(绝不能保存在纯水中)。在保存中，DNA可发生降解，如果保存期超过1个月，在使用前应重新沉淀DNA，并再溶于0．1SSC中；如果重新沉淀时，DNA不产生沉淀，应弃掉。如在－70℃很快冷冻并在－20℃保存，DNA可保存更长时间或1年。