糖类代谢试验

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一、糖发酵试验

(一)培养基

蛋白胨水(pH7．4～7．6) 100ml

氯化钠 0．5g

所需糖、苷或醇类物质 0．5～1g

1．6%溴甲酚紫酒精溶液 0．1ml

溶解各成分，加入指示剂混匀，分装试管；管内装有倒置的小玻璃管(德汉氏发酵管)。亦可省去小管，制成半固体培养基。经115℃20min灭菌。

(二)厌氧菌糖发酵培养基

蛋白胨 2g

氯化钠 0．5g

硫乙醇酸钠 0．1g

所需糖、苷或醇 1g

琼脂 0．1g

1．6%溴甲酚紫酒精溶液 0．1ml

蒸馏水 100ml

除指示剂外，各成分加热溶解后，调pH为7．2～7．4，加入指示剂，分装试管，经115℃20min灭菌。

注：厌氧菌的糖发酵试验亦可用普通糖发酵培养基，接种后应放在厌氧环境中培养。

(三)血清半固体糖发酵培养基

0．3%肉膏(pH7．6) 100ml

琼脂 0．3g

所需糖、苷或醇 0．5～1g

0．5%酸性复红 2ml

兔血清或小牛血清 10ml

1．取肉膏汤100ml，加入琼脂，煮沸溶化后，加入糖及指示剂，113℃20分钟灭菌。

2．待培养基冷至50℃左右，加入已经56℃30min灭活的兔血清10ml，分装于无菌试管，无菌检查后备用。

(四)试验方法 取18～24h的试验菌接种于培养基中，置37℃培养2～3天后观察，指示剂由紫色变为黄色，这表示糖类发酵产酸，以“+”表示。若试管内倒置的小管内有并气泡出现，则表示产酸和产气，以“”表示；若指示剂颜色未改变，则表示对糖类不发酵，以“-”表示。

注：半固体糖发酵培养基作穿刺接种，除观察产酸和产气外，尚可观察细菌的动力。

二、葡萄糖氧化-发酵试验(即OF试验，亦称HL试验)

(一)培养基

蛋白胨 0．2g

氯化钠 0．5g

磷酸氢二钾(K₂HPO₄) 0．03g

葡萄糖 1g

琼脂 0．5g

蒸馏水 100ml

1%溴麝香草酚蓝水溶液 0．3ml

除指示剂外，溶解以上各成分，调pH为6．8～7．0，加入指示剂，分装试管，经115℃20min灭菌。

(二)试验方法 将试验菌穿刺接种，每株菌接4支，其中2支用无菌石蜡(约0．5～1cm厚)封盖，以隔绝空气为闭管。另2支不加石蜡为开管。同时设有不接种的闭管作对照。经37℃培养1、2、4、7天后观察，氧化型产酸者仅开管产酸；发酵型产酸者，则开管和闭管均产酸。如产气则在琼脂柱内产生气泡。开管闭管均不产酸者为不定型的反应。

(三)原理 细菌对糖类利用有两种类型，一种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。这一实验广泛用于细菌分类鉴定。

三、葡萄糖酸盐的氧化试验

(一)试剂

1．pH7．2的磷酸缓冲液

2．斐林试剂

甲液 结晶硫酸铜 34．64g

蒸馏水 加至 500ml

乙液 酒石酸钾钠 173g

氢氧化钾 125g

蒸馏水 加至 500ml

使用时将甲液和乙液等量混合，当日使用。

(二)试验方法

1．用pH7．2的磷酸缓冲液配制含有1%葡萄糖酸钠(或葡萄糖酸钙)溶液，分装于刻度试管，每管2ml。

2．取试验菌18～24h的菌苔加入盛有2ml1%葡萄糖酸钠液试管至3ml，制成浓悬液，置30℃过夜，每管加0．5ml斐林试剂。

3．放入沸腾的水浴中加热10min，试管中液体由蓝色变为黄绿、绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，不变色者为阴性。

(三)原理 假单胞菌和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2一酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸无还原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林试剂中蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu₂O沉淀。

四、甲基红试验(M．R．试验)

(一)培养基

蛋白胨 0．7g

葡萄糖 0．5g

磷酸氢二钾(K₂HPO₄) 0．5g

蒸馏水 100ml

各成分溶解后，调pH为7．2～7．4，分装试管。经115℃20min灭菌后，备用。

(二)试剂

甲基红 0．02g

95%酒精 60ml

蒸馏水 40ml

先将甲基红研磨溶解于酒精中，可加蒸馏水即成。

(三)试验方法 将试验菌接种培养基中，3 7℃培养48h。取少量培养液于另一小试管中，并加几滴试剂，如培养液呈现红色，为甲基红试验阳性；黄色者为阴性，仍继续培养4～5天，再进行试验。

(四)原理 M·R．试验是测定细菌分解葡萄糖产酸的程度。若所产生的酸足以降低pH值到4．2或更低，此时加入甲基红指示剂呈红色。(甲基红变色范围为pH4．4红色～6．0黄色)。

五、维培二氏试验(V．P．试验)

(一)培养基同M·R．培养基

(二)试剂及方法

1．Barritt’s试剂法

甲液：6%α-萘酚酒精溶液。

乙液：40%氢氧化钾溶液。

取M·R．试验的同一培养物约2ml，加入甲液1ml，乙液0．4ml，充分混合，观察结果。

2．O′Meara′s试剂法

氢氧化钾(或氢氧化钠) 40g

肌酐Creatine 0．3g

蒸馏水 100ml

取上述同一培养物约2ml加等量试剂相混合，充分振荡试管。

3．硫酸铜试剂法

硫酸铜 1g

浓氨水 40ml

10%氢氧化钾 960ml

硫酸铜溶化于40ml浓氨水中，加10%氢氧化钾即成。试验时加等量的试剂于培养物中混合。

上述几种方法，在5min内呈粉红色反应为阳性；如为阴性反应，置37℃，4h后，再行观察。

(三)原理 某些细菌能分解葡萄糖产酸，并将酸转化为乙酰甲基甲醇或2，3-丁二醇等中性物质。若在其中加碱，并充分振荡，两种物质可被氧化为二乙酰，它再与培养液中的胍基结合生成红色化合物。

六、淀粉水解试验

(一)培养基

营养琼脂(pH7．2～7．4) 100ml

可溶性淀粉 0．2g

装入三角烧瓶，经121℃20min灭菌。

(二)试剂 路哥(Lugol)氏碘液(见革蓝氏染色法)。

(三)试验方法 将培养基溶化后，冷至50℃左右，倒成平板，凝固后，取试验菌点种于平板上，每皿可点种3～5个菌株，37℃培养48～72h。形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，必须以铺满菌落周围为宜。菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，平板仍呈蓝色。

(四)原理 许多细菌产生淀粉酶，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不呈现蓝色。

七、β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)

(一)试剂

1．缓冲液 称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)6．9g，溶解于45ml蒸馏水中，加约3ml30%氢氧化钠，调pH7．0，并补足水至50ml。放4℃冰箱中备用。若析出结晶，用前稍加温使其溶解。

2．ONPG液 称取80mgONPG，溶于15ml蒸馏水中，置37℃中，加入5ml缓冲液。溶液应是无色，置4℃冰箱保存。若出现黄色，则不能应用。使用前，先将ONPG液加温至37℃。

(二)试验方法

1．将试验菌接种到三糖铁或1%乳糖肉汤琼脂上，经37℃培养过夜。

2．挑取1满环试验菌置于0．25ml生理盐水中，制成悬液，置37℃5min，加一滴甲苯，摇匀，以利于半乳糖苷酶的释放。

3．取0．25mlONPG液加入悬液中，置于37℃水浴中，分别在30min和3h后观察，若呈现黄色者为阳性。

(三)原理 具有半乳糖苷酶的细菌，能水解ONPG而释放出黄色的邻硝基酚。

八、七叶苷水解试验

(一)培养基

胰蛋白胨 1．5g

枸橼酸铁 0．2g

七叶苷 0．1g

蒸馏水 100ml

安氏指示剂(Andrade′s indicator) lml

琼脂 2g

除指示剂及琼脂外，各成分溶解后，调pH为7．0，加入琼脂煮沸溶解后，再加入指示剂，混匀后，分装试管。经115℃20min灭菌，摆成斜面。省去琼脂亦可，液体培养基同样可用。

(二)试验方法将培养18～24h的试验菌接种于上述培养基上，37℃培养24h观察，若培养基变黑色者为阳性。

(三)原理 有些细菌能分解七叶苷，其代谢产物与铁离子结合，产生黑色沉淀。

九、石蕊牛乳试验

(一)培养基

1．脱脂乳的制备 取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心(3000r／min，10min)，除去上层脂肪，即得脱脂乳。

2．2．5%石蕊水溶液的配制

石蕊 2．5g

蒸馏水 100ml

将石蕊浸泡在蒸馏水中过夜，使石蕊变软易溶解，必要时再用乳钵研磨，过滤，即得石蕊液。

3．石蕊牛乳的配制

脱脂牛乳 100ml

2．5%石蕊液 0．4ml

或1．6%溴甲酚紫酒精溶液 0．1ml

混匀后，分装试管，间歇灭菌3次。如培养厌氧菌，则在乳上面加盖一层灭菌石蜡。

(二)试验方法 试验菌接种培养基中，37℃培养1～7天，观察产酸、产碱、胨化等反应。

1．产酸——细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。

2．胨化——细菌产生蛋白酶，分解酪蛋白，故牛乳变得澄清。

3．产碱——细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。

4．酸凝固——细菌发酵乳糖，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固。

5．凝乳酶凝固——某些细菌能产生凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。

6．还原——细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电势降低，因而石蕊退色。

(三)原理 在牛乳中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色；酸性时呈粉红色；碱性时呈蓝色；还原时则自下而上退色。

十、甘油品红试验(glycerol fuchsin test，1916 stern氏)

(一)培养基

1．牛肉膏 1g

蛋白胨 2g

蒸馏水 100ml

溶解各成分，调pH为 8．0

2．10%碱性品红酒精溶液 0．2ml

3．新配制的10%无水亚硫酸钠水溶液 1．66ml

4．甘油 1．0ml

(1)取1加4后，121℃15min灭菌备用。

(2)临用时加入2和3，分装无菌试管。

(二)试验方法 试验菌接种于上述培养基中，37℃培养，观察8天，并设同样培养基作空白对照。若阳性呈紫色、弱阳性呈紫红色、阴性与对照管颜色一样。

(三)原理 甘油经酵解作用生成丙酮酸，并脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物呈紫色。