细菌染色技术bacterial staining techni-ques

将菌体固定于玻片上，选用不同染料着色，增加其色差，以显示菌体形态的一项细菌学基本技术。细菌细胞物质与各种不同染料亲合力不同，用各种特殊染色法还可显示菌体内部和外部的细微结构及其组分，还有些染色法本身就是一种细菌鉴别分类的方法。
细菌细胞含有大量水分，菌体小，较透明，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大，与周围背景不能形成鲜明对比。染色是借助理化因素的作用，细菌对染料的毛细现象、渗透、吸附以及根据菌体和染料的不同性质而发生各种化学反应。另外细菌的等电点pH值大约在2～5之间，在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷； 而碱性染料电离时染料离子带阳电荷，因此，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
细菌染色方法可归纳为： ❶单染色法。所用染料仅一种，染色结果只能表现出一种颜色；
❷复染色法。所用染料在两种以上，染色结果，不同微生物可显示出不同颜色，有助于鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法，常用的复染色法有革兰染色法和抗酸性染色法；
❸特殊染色法。某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊构造，这些构造不能被一般染色法着色，必须用特殊方法着色；
❹负染色法。即细菌本身不着色，而由有色背景将无色的细菌衬托出来。
单染色法 此法简单易行，常用结晶紫、美蓝、孔雀绿、碱性复红等。若使用刚果红、伊红和酸性品红等酸性染料时，必须降低染液pH值，使其呈强酸性（低于菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料着色。单染色法一般经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。染色结果，按染料的不同，呈现不同的颜色。
革兰染色法 1884年由丹麦医生革兰 (C. Gram)创立。应用此法染色可将细菌分为两大类，一类为革兰阳性(G+)菌呈现紫色，另一类为革兰阴性(G-)菌呈现红色。革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁的化学组成和生理性质有差别（见细菌细胞壁）。革兰阳性菌的细胞壁无分化结构，其化学组成主要是肽聚糖，含脂类少，经95%酒精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫与碘形成的紫色染料复合物洗出胞壁外，更主要的是革兰阳性菌含有特殊核蛋白质镁盐与多糖复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，通透性小，不易脱色，这是染色反应的主要依据。另外革兰阳性菌的等电点比阴性菌低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，不易脱色。而阴性菌细胞壁薄，含肽聚糖少，在肽聚糖层外有由脂蛋白，脂多糖等组成多聚物，当95%酒精脱色时易将脂质洗去，而且阴性菌与特殊蛋白质镁盐和多糖复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，而后为红色染料着为红色。革兰染色法一般包括初染（草酸铵结晶紫溶液）、媒染（革兰碘溶液）、脱色(95%酒精溶液)、复染（沙黄水溶液）四个步骤。染色时可将阳性菌和阴性菌混合作一涂片，染色结果，在一个视野中既观察到紫色阳性菌又可见红色阴性菌。
抗酸性染色法 抗酸性质主要为分枝杆菌属的细菌所特有，此外，放线菌、酵母菌的子囊孢子等也都具有抗酸性质。一般认为石炭酸和复红是按分配系数分布于细菌、染色液和脱色剂中。分枝杆菌属含有多量脂类、提取和保留的石炭酸与染料较多，褪色时，染料、石炭酸溶于抗酸菌细胞内的量比溶于脱色剂中为多，菌体保存有染料。而非抗酸菌正相反。抗酸性染色常用萋-纳二氏染色法，染色时可将抗酸菌和非抗酸菌混合作一涂片。染色结果，在一个视野中既观察到抗酸菌为红色又可见非抗酸菌为蓝色。
姬姆萨染色法 常用于血片及组织触片，一般不用火焰固定，以免破损组织细胞结构，影响观察细胞结构、形态。必要时用化学固定法，如甲醇、丙酮等，因姬姆萨染料溶于甲醇中配制，故可先滴加姬姆萨染液作固定。为获得清晰的标本可采用慢染法，将血片或组织触片自然干燥后，浸入盛有稀释姬姆萨染液的染色缸中(母液1份加甲醇3份，染色30分钟； 1:10稀释染色60分钟； 1:20稀释染色3小时或过夜)。染色结果，组织细胞呈多色性，菌体呈蓝青色，视野呈粉红色。
荚膜染色法 荚膜是细菌在新陈代谢过程中分泌于细胞壁外的粘液状物质，其主要化学成分是多糖或多肽物质，荚膜的折光性低，与染料的亲和力差，不易着色，通常将菌体染色后，再使背景着色，这样可把透明的荚膜衬托出来。染色时用接种环取培养4～5小时的幼龄巴氏杆菌一耳与一滴墨汁于玻片上混合，再用另一干净玻片蘸取混合物作推片，自然干燥，甲醇固定8分钟，不用水冲洗，加石炭酸复红染液，经5分钟后用水冲洗。染色结果：菌体红色，背景黑色，菌体外包一层透明圈可比菌体大2～3倍即为荚膜。如有炭疽病畜的血片或组织触片，以久储的多色性美蓝染液作单染色法，荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。
芽孢染色法 细菌芽孢含水量少，含脂量较高，有多层芽孢膜，芽孢壁较厚，结构坚实，折光性强，对染料的通透性差，不易着色，一般采用加热法进行染色，一旦着色后难以脱色。染色时取已产生芽孢但仍保留菌体的细菌培养物，染色结果，芽孢呈红色，菌体呈蓝色。
鞭毛染色法 鞭毛非常纤细，光镜无法直接观察，必须用媒染剂吸附在鞭毛上，使鞭毛加粗。染色用的载玻片要特殊处理，高度清洁； 用短期内多次移植的幼龄培养； 染色液需新配制，才能得到理想的染色结果。菌体蓝色，鞭毛红色。
异染颗粒染色法 某些细菌细胞质中含有一种酸性小颗粒，是由核蛋白和磷酸构成的内含物，又称捩转菌素。异染颗粒易被美蓝染色，并显示与细胞其他部分的颜色不同，因此叫异染颗粒。白喉杆菌、鼠疫杆菌等的细胞内都含有异染颗粒。染色方法有阿尔培法，菌体呈蓝绿色，异染颗粒呈蓝黑色； 奈瑟法，菌体呈黄褐色，异染颗粒呈深紫色； 庞特法，菌体呈蓝色，异染颗粒呈深蓝色。
负染色法 此法采用刚果红酸性染料，使菌体不易着色而背景的刚果红经酸处理后成为游离酸，呈蓝色，将无色菌体衬托出来。
细菌学上应用的染料都是带色含有苯环的有机化合物。染料分子都由苯环、连接在苯环上的发色团和助色团三部分组成。助色团有电离性质，能与适当的物质结合成盐类，带有正或负电荷的染料离子便能与细胞较牢固地结合，使其呈现颜色，如无助色团，即使发色团能覆盖在细胞上呈现颜色，由于它不能电离，不能形成盐类，与细胞的亲和力差，因此，可用机械法除去，不能作为染料。
染料分为天然染料和人工染料两种。目前主要采用人工染料，多数从煤焦油中提取获得，是苯的衍生物。为带色的有机酸或碱类，难溶于水，易溶于有机溶剂中。为使它们易溶于水，常制成盐类，按其电离后染料离子所带电荷的性质，分为两大类： ❶酸性染料。这类染料电离后染料离子带负电，如伊红、刚果红和酸性复红等。当培养基因糖类分解产酸使pH值下降时，细菌所带正电荷增加，选用酸性染料易被着色；
❷碱性染料。这类染料电离后染料离子带正电，如美蓝、结晶紫和碱性复红等。在一般情况下细菌易被着色；
❸中性（复合）染料。酸性染料与碱性染料的结合物。如姬姆萨染料等；
❹单染料。这类染料大多数属于偶氮化合物，不溶于水，溶于脂肪溶剂中，其染色能力视其是否溶于被染物而定，如紫丹类染料。