显微分光光度测定法

显微分光光度测定法是利用显微分光光度计测定细胞内核酸、化学物质、色素和细胞器等成分含量的方法。显微分光光度计又称显微光度计或细胞光度计，由Caspe-rson于20世纪30年代始创和应用。经Pollister (1949)和Swift (1950)将其结构简化后，已广泛用于生物学研究。其原理是根据Beer-Lambert定律，用适当的波长，根据不同化学物质对特定波长单色光的特异性吸收，可以求出该物质的浓度和含量，从而在显微镜下对样品的微细结构物质进行定量的测定。这是一种在形态定位的基础上，对所测的化学成分进行显微定量的客观方法，克服个人在形态学观察定量中的主观因素，而且用具体数字表示形态学上某一物质的量改变。也可以说是分光光度测定法的显微化。
显微分光光度计有各种类型，但其基本部件均与一般的分光光度计相似，包括光源、单色光器、比色皿和测光装置(有光电池或光电倍增管、放大器、电流计)，只是在分光光度计的比色皿位置上换成观察生物样品的显微镜。

显微分光光度计结构原理

利用显微分光光度计可以原位测得单个细胞、单个细胞核或核仁内的核酸、细胞器、细胞色素或其他化学物质的含量。被测定的标本面积，可以小到0.5μm直径。在生物形态学中，常用于染色标本中的化学物质的定量测定，通常只能求得相对含量。只要染色反应与被测物质含量之间具有恒定的比例数字，任何标本均可用显微分光光度计测定。此法最常用于Feulgen染色标本中DNA的测定。此外，还可测定甲基绿及铬棓花青(gallocyaninechrome-alum)染DNA和RNA，天青B染RNA,PAS染糖原，millon反应及萘酚黄S (naphthol yellow S)染蛋白质，固绿FCF及Biebrich猩红染碱性蛋白质等的含量。
除可见光的显微分光光度计外，还有荧光显微分光光度计，用于测定不染色的标本和活细胞中的化学物质的含量。由于可以预先测知所测物质的比消光系数，这种显微分光光度计可以求得细胞内化学物质含量的绝对值。例如可测得细胞内蛋白质、核酸、细胞色素P-450等的定量。近年还有流水式显微分光光度计(Flow-MSP)问世，它可以自动描记测定逐个细胞内物质的含量。
中国学者曾应用显微分光光度测定技术研究人食管上皮癌变过程中食管上皮细胞的DNA含量，发现胞核内DNA含量在癌变过程中逐级增高，正常和轻度增生上皮细胞的DNA平均含量均小于四倍体数值，重度增生上皮细胞的DNA平均含量超过四倍体，六倍体的出现是重度增生的特征，八倍体和非整倍体胞核的出现是癌的特征。用药物治疗食管上皮重度增生，在细胞学上显示有效的病例，其胞核DNA的平均含量显著降低，六倍体、八倍体和非整倍体等异常群体细胞明显减少或完全消失。上述研究说明了显微分光光度测定法对于鉴别细胞良恶性方面有一定的价值。