植物组织培养的器官分化及其应用

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近年来由于植物细胞全能性的证实，植物体细胞通过人工培养方法，经过细胞的器官分化可获得再生植株。

在此基础上发展到单倍体育种，无性系快速繁殖，原生质体培养，体细胞杂交，基因的转移，细胞悬浮培养产生胚状体以研制人工种子等等。因此，离体的植物组织和细胞培养是一个良好的研究体系，人为给予各种条件并加以调控，从而塑造一种或多种的器官分化途径，不仅可阐明有关的细胞分化现象，而且可开拓许多实际应用的前景。

1902年，哈伯莱德(G．Harberlandt)即预言植物细胞具有全能性。1934年，温特(F．W．Went)发现了生长素——吲哚乙酸，随后相继发现吲哚丁酸及萘乙酸、2，4－D等人工合成的生长调节物质。

1937年，怀特(P．R．White)发现维生素B族是根尖培养中必需的成分，并首先建立了人工合成培养基，1943年又出版了第一本专著——《植物组织培养手册》，始有较大的发展。这一期间李继侗和沈同(1933)用银杏胚乳提取物，使银杏胚培养获得成功。

1934～1940年，罗宗洛和罗士韦研究了玉米等根尖的培养。1940年，俄菲毕克(J．van．Overbeek)用椰子的液体胚乳于培养基中，使心形期的曼陀罗杂种幼胚培养成功。

1945年，斯柯克(F．Skoog)和崔澂发现腺嘌呤促进细胞分裂，并诱导烟草茎髓愈伤组织形成芽。1945年，罗士韦发现在光照下石刁柏茎尖可以重复割切培养，1946年在菟丝子茎尖培养中观察到花芽形成并开花。1952年摩尔(G．Morel)等将感染病毒的大丽花茎尖切离培养，获得去病毒植株。1953年，缪尔(W．H．Muir)发明摇床振荡的液体培养法，即细胞悬浮培养技术，以后还设计看护培养技术，诱导单细胞生长分裂使培养获得成功。

1956年，米勒(C．O．Mille)发现了激动素，随后又发现了一系列类似化合物，将其统称为细胞分裂素。1958年，瑞奈尔特(J．Reinert)和斯梯瓦尔特(C．Stewart)分别发表了由胡萝卜根髓愈伤组织制得的单细胞，经悬浮培养产生大量的胚状体和由此发育生长的小植株，首先证明了高等植物细胞的全能性。

1960年，柯金(E．C．Cocking)采用纤维素酶和果胶酶等制剂分离番茄根尖，获得大量的原生质体。1962年，村重(T．Marashige)和斯柯克(F．Skoog)发表了促进烟草愈伤组织快速生长的培养基成分，即目前通行并卓有成效的MS培养基。

1964年，嘎哈(S．Guha)等培养毛叶曼陀罗未成熟花药，发现由胚状体形成的小植株并证明起源于花粉粒，系单倍体植株，从而发展了单倍体育种技术。1971年，长田(T．Nagata)与建部(I．Takebe)首次报道烟草原生质体通过细胞壁的再生，细胞分裂再生出完整植株，再次确认了细胞(原生质体)的全能性。

1972年，卡而松(P．S．Carlsoh)完成了粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质融合，实现了细胞杂交。

植物组织培养的器官分化途径，除上述茎尖培养、愈伤组织的器官分化和胚状体方法外，1958年魏克松(M．Wickson)和锡曼(V．Thimann)发现用外源细胞分裂素，可促进休眠的侧芽萌动形成丛生枝，将嫩梢重复割切，可不断复制出大量小植株，这第4种再生植株方式也成为木本植物快速繁殖的重要方法之一。1960年，摩尔(G．Morel)用兰属植物茎尖培养形成原球茎，达到去病毒和快速繁殖的目的，成为再生植株的第5种方式，一年内一个茎尖可繁殖出400万株，使许多国家兴起兰花工业，成功地将66属以上兰种植物进行试管繁殖。

1957年，罗勃(S．M．Robb)在百合鲜茎的鳞片切块培养中，观察到由分化出的芽形成子鳞茎。1975年帕瑞克(R．L．M．Pierik)在风信子小鳞茎切块培养中也分化出小鳞茎。1971年，锡摩生(J．Simonsen)用唐菖蒲球茎茎顶培养可诱导形成小球茎。

1990年李文安用观叶海棠叶柄和叶片培养，直接分化形成小圆球茎。1963年，李正理等在草石蚕的离体茎端及1967年，俄卡萨瓦(Okazawa)在马铃薯的匍匐茎或茎切段培养中，均观察到块茎的形成。

1991年，李文安用花叶芋的叶柄或叶片培养形成小芋块，其上分化出芽和根。

这是鳞茎植物、球茎植物、块茎植物经组织培养产生再生植株的6、7、8种方式。

1973年，撞恩(T．van Tran)等人发现用烟草开花植株茎表皮的3～10层细胞进行薄层培养，在培养基和环境条件的调控下，不仅从外值体分化出芽和根，还可直接分化出花芽，形成花芽的数目在供体植株上是从下至上的增加，提出成花梯度的假说。这为组织培养能直接分化出繁殖器官，大为缩短植物的开花周期开拓了新的途径。

1989年，李文安进一步发现烟草薄层培养成花的能力，随供体植株开花期的盛衰而变化，并且花序的苞叶离体培养也能直接分化出花芽。花卉植物如万寿菊的薄层培养应用于无性系快速繁殖，具有提早开花的效果。

植物组织培养的上述各种分化途径，在当前这一技术还处于依赖经验的情况下，除在理论上深入研究植物细胞分化的机理外，同时也在实际应用方面进行了开拓。中国在“六五”、“七五”(1980～1990年)规划中，中国科学院北京遗传研究所和植物研究所报道了适合禾本科稻、麦组织培养的N₆和马铃薯培养基，提高了再生植株的分化率，并可用于花药培养，为国外所引用。70年代初，中国的上千个机构从事单倍体育种，据统计现已有23科52属160多种植物获得单倍体植株，其中至少24种以上是中国学者首先完成的，并获得了新品系或新品种水稻60个，小麦20多个，甜(辣)椒5个及一批有意义的成果。进入80年代，中国近3000个单位开展了无性系快速繁殖珍、稀、名、优等濒危植物的研究，有的已进入不同规模的应用阶段成为生产实体。

香蕉、甘蔗、草莓、葡萄、菠萝、桉树及各种观赏植物，脱毒的马铃薯、菖兰、香石竹等均已推广应用。1970年，上海植生所开始试制EA3－867纤维素酶制剂，其效能与日本的产品相同。中国在玉米、小麦、水稻、小米、高粱、大豆、芸苔类、马铃薯、地瓜、黄瓜、胡萝卜、枸杞、茯苓、桑树、杨树等植物上均已获得原生质体再生植株。

1977年村重(T．Murashige)提出植物体细胞胚可像种子一样应用的人工种子的设想。10余年来在胡萝卜、芹菜、柑桔、苜蓿、玉米、甘蔗、石刁柏、黄连、刺五加等植物均已获得重大进展，有的国外研究者已申请专利。中国也已开展此项研究，特别在采用顶芽、腋芽、小鳞茎等包裹制作人工种子，如百合、花叶芋及桉树、桑木、杨树也获得较多成就。

植物体细胞杂交方面，据统计种内杂交有8例，种间杂交有32例，均以茄科植物为主，其中中国也有2例。1981年，拉尔金(P．J．Larkin)等报道，从甘蔗中筛选出抗眼点病和斐济(Fiji)病的突变体也推广应用。

目前至少在14种植物筛选出31个表现型，其中有14个再生出植株，5例报道了所选择的性状能经有性过程传递。中国在抗病、抗盐、抗冷、抗除草剂、抗4－氧顿氨酸的突变体或变异体的筛选上，也获得一些成就。这些突变体在理论研究，为原生质体融合和遗传操作，并导致作物改良提供材料方面均有很大意义。自1976年倍坚(Y．P．S．Bajay)开始报道以来，植物组织细胞培养物的超低温保存及其种质库的建立，日益受到重视。

芽、茎尖、花粉、胚状体和幼胚、愈伤组织与悬浮培养的细胞、原生质体等培养物，在液氮超低温贮存后，仍能保持很高的存活率并能再生出新植株，对植物种质的长期保存将做出重大贡献。

。【参考文献】：

1 Murashige T. The impact of Plant Tissue Culture on Agriculture. Canada:Uni of Calgary, 1978. 518-524

2 Tran Thanh Van K. Ann Rev Plant Physiol. 1981,32I291～ 311

3 Collins G B. Plant Cell and Tissue Culture Washington,D C:National Academy Press. 1982. 230～253

4 Bhojwani S S,Razadan M K. Plant Tissue Culture Theory and Practise Amsterdam Elsevier: 1983. 1～10

5 Tran Thanh Van K, et al. Handbook of Plant Cell Culture-New York; Macmillan Publishing Company, 1986,4:316-- 335

6 罗士韦，许智宏，主编．经济植物组织培养．北京：科学出版社，1986

7 孙敬三，陈维伦，主编．植物生物技术和作物改良．北京：中国科学技术出版社，1990

8 李修庆，主编．植物人工种子研究．北京：北京大学出版社，1990

9 陈英，主编．植物体细胞无性系变异与育种．南京：江苏科学技术出版社，1990

10 李文安．植物的器官分化与试管植物．植物生理专题讲座(第2册)．北京：科学出版社，1992

(中国科学院上海植物生理研究所李文安研究员撰；罗士韦审)

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"植物组织培养技术植物组织培养技术

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在无菌和人工控制条件下，对植物的原生质体、细胞、组织和器官进行离体培养，并控制其生长发育的一门技术。

是当今世界新技术革命的重要组成部分。它为植物生理学、细胞学、胚胎学、发育遗传学等学科的研究提供了有效而简便的方法，为现代作物育种创造新的变异体、脱毒原种、繁殖体及从远缘种、属中导入优良基因提供了可能和条件，促进了现代农业生物工程产业的兴起。(1)关键技术。调节培养基中细胞分裂素和生长素的浓度的比例是实现再分化过程的主要条件之一。

F．斯库和崔澂(1948年)发现腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素IAA对芽形成的抑制作用，从而诱导烟草的茎切段形成芽，即腺嘌呤与IAA的比例高时可促使形成芽，反之产生根。米勒(1956年)发现了激动素，它能代替腺嘌呤促进芽的形成，效果可提高上万倍，从而使控制器官分化的激素模式由腺嘌呤／AA改为激动素IAA的比例。

(2)类别。根据所培养的对象植物组织培养又可划分为器官培养(如繁物的根、茎、叶、花药、子房、胚珠、胚等)、细胞悬浮培养和原生质体培养。

这些培养物在相适宜的培养基中，在一定的温度和光照条件下生长发育。培养基成分包括大量和微量无机盐、维生素和氨基酸。一般以蔗糖作碳源，并根据培养目的添加不同种类和浓度的植物激素，还常附加天物植物提取液，如椰子汁、水解乳蛋白、酵母提取液等以补偿营养成分和激素的不足。(3)器官培养。

以植物的根、茎、叶、花药、子房、胚珠、幼胚等器官作外植体，接种在适宜的琼脂固体培养基上，生长出新的植株或经过脱毒分化再生出新的植物个体的培养技术。在作物育种实践中常遇到种间、属间杂种胚或胚乳早期败育退化而得不到有生活力种子的现象，E．莱巴赫(1925年、1929年)首次利用胚胎离体培养技术获得亚麻种间杂种植株的成功尝试，为胚胎培养技术卓有成效地应用于植物育种实践奠定了基础。至今通过胚胎培养技术已在20余种植物中得到了种间杂种，在10多个属间杂交组合中获得了属间杂种。通过器官培养再生成植株的植物已达600多种，其中众多有经济价值的植物采用组培快迅繁殖法实现了商品化生产。中国组培快繁植物已有100多种，其中甘蔗、无籽西瓜等已实现了工厂化育苗生产。由茎尖培养获得无病毒植株“茎尖脱毒”技术，已在马铃薯、甘薯、大蒜，百合等植物中取得成功。其中马铃薯茎尖脱毒培养已用于生产得到显著效果。无性繁殖的以及在自然条件下不能开花、结籽、作物，采用器官培养技术，不仅可以繁衍和保存种质，且宜长途运输，便于交流。

花药培养是单倍体育种的主要途径之一。中国在这方面处于国际领先地位。细胞悬浮培养。将新鲜的易分散的愈伤组织转移到盛有液体培养基的培养瓶中，并在摇床上进行连续振荡培养。

经过若干次继代培养后，可得到均匀分散的细胞悬浮液。细胞悬浮液中一般不含较大的团块组织，而是游离的植物细胞和由几个到几百个细胞组成的聚合体，形成较为均一的体系。

它不仅是细胞生理学家和生化学家研究细胞生长和代谢的工具，也为原生质体培养、细胞突变体的诱发和筛选，提供了理想的材料。从1953年米尔首先进行烟草和万寿菊的细胞悬浮培养取得成功以来，又陆续在菜豆、大豆、人参、玉米、高梁、甘蔗等作物上获得成功，为生产人工种子和实现工厂化无性育苗提供了可能。