食用菌制种preparation of mushroom spawn

分离培养和扩大食用菌菌种的技术与工艺过程。包括纯种分离培养，母种、原种和栽培种制作等步骤。
制种技术的历史 1894年法国康斯坦丁(L.Con-stantin)等人以蘑菇孢子分离和组织分离为基础，首先创立纯菌种制种技术，但将技术保密了数十年。1902年达格尔(B.M.Duggar)用蘑菇组织培养纯菌种成功。1930年美国农业部的兰伯特(E. B. Lambert)用蘑菇孢子培养纯菌种成功。1928年日本森本彦三郎用木屑米糠培养基培养香菇、金针菇菌种获得成功。中国的食用菌菌种制作事业起步较晚，中华人民共和国成立前，菌种制作一直未进入商品性生产的阶段。50年代后期，上海等地开始进行较大规模的食用菌菌种生产。60年代，中国食用菌科技人员在世界上首创银耳及其伴生菌的混合纯种制作技术，大大促进了银耳生产的发展。70年代以来，中国食用菌科学工作者在液体菌种和合成材料颗粒菌种的制作等方面进行探索、研究，取得了较大进展。
菌种类型 依菌种的物理状态可分为液体菌种和固体菌种。液体菌种是用摇瓶培养或深层通气培养制得的含大量微小菌丝球的液态菌种。固体菌种是以谷粒、木屑等含有适当水分的固体材料为基质制得的菌种，生产中广泛应用。依菌种培养料的不同，可分为谷粒菌种、粪草菌种、木屑菌种、木块菌种、棉子壳菌种等。前两种主要用于双孢蘑菇、双环蘑菇的菌种制作。木屑菌种、木块菌种则广泛用于香菇、木耳等木腐菌的菌种制作。棉子壳菌种在侧耳、凤尾菇等菌种的制作中应用较为普遍。按照在菌种制作过程中逐级扩大培养的次序可分为母种、原种、栽培种。用纯种在琼脂斜面上转管繁殖所得的试管斜面菌种称为母种（一级种）。用母种在固体培养料上扩大繁殖所得的瓶装菌种称为原种（二级种）。用原种在固体培养料上扩大繁殖所得的瓶（袋）装菌种称为栽培种（三级种）。
纯种分离 用孢子、子实体等适宜材料通过无菌操作获得纯培养菌种的技术。食用菌纯种分离一般采用三种方法，即孢子分离法、组织分离法及基内菌丝分离法。不同的食用菌采取不同的分离法获得纯菌种。以上三种方法仅适于营独立生活的腐生菌，那些与树根及草根共生的菌根菌是很难在简单的培养基上获得纯菌种的。无论用何种方法获得的菌种，均需经过出菇（耳）鉴定，待证实某一菌株确系纯种且具有优良生产性能后，方可作菌种使用。
孢子分离法 利用菌类产生的孢子，在适宜的培养基上萌发，长成菌丝体而获得纯菌种的一种方法。菇类的孢子有有性孢子(担孢子、子囊孢子)和无性孢子(如草菇的厚垣孢子、银耳的酵母状分生孢子、节孢子、黑木耳的分生孢子等)。在分离时可采用有性孢子分离法，也可采用无性孢子分离法。但在一般菌种生产过程中为了避免异宗结合的菇类，如侧耳、香菇等产生单孢不孕现象，因此都采用多孢分离法，单孢分离常应用于菌类的杂交育种工作。多孢分离法的操作步骤（以双孢蘑菇为例）:选取菇形圆整、色白、柄粗的单生蘑菇，在菌幕即将破裂之前采下，切去带泥的菌柄基部，表面用清水洗净、吸干，浸入0.1%的升汞水中消毒30～60秒钟。用无菌水冲洗种菇表面残留的升汞(HgCl₂)，将表面水分吸干后，插入孢子收集器(图1)，然后移入22～24℃温度下培养，两天左右培养皿内落下一层深咖啡色孢子粉。将孢子收集器移入无菌箱（室）中，将培养皿取出封好备用。在无菌条件下，将培养皿中孢子稀释至淡咖啡色，用消毒过的注射器吸入5毫升，滴1～2滴于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上。接种的试管，移入24℃左右培养室内培养，9～12天后萌发成肉眼可见的星芒状菌落，逐个挑选到另一试管中，选取生长势强的若干菌落，作出菇鉴定后定为菌种。

图1 孢子收集器

组织分离法 利用子实体内部组织获得纯菌种的一种简便的分离方法，是野外采种时常用的方法之一，但对子实体小、薄及胶质的种类不太适用。根据分离材料的不同，组织分离可分为三类，即子实体组织分离(图2)；菌核组织分离：菌索分离。子实体组织分离法的操作步骤（以香菇为例）为：选取香菇优良品系中的优良个体，选朵大盖厚，柄粗而短，八九分成熟的子实体作为种菇。切去菇柄基部，将种菇进行表面消毒。在菌柄与菌盖交界处挑取一小块组织，移接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，置25℃左右处培养。经3～5天即可看到组织块上长出白色绒毛状菌丝，并在培养基上生长，经过一次转管纯化即得香菇菌种。

图2 子实体组织分离示意图

基内菌丝分离法 利用长入基质的菇类的菌丝获得菌种的一种分离方法。这种方法的缺点是污染机会较多。能用孢子分离与组织分离得到菌种的菇类一般不用这种方法，仅适用某些特殊菌类如银耳，因为只有银耳菌丝与伴生菌的菌丝同时存在才能形成具有商品价值的银耳子实体。根据食用菌生长基质的种类，基内菌丝分离法又分菇（耳）木分离法及土内菌丝分离法。后者因杂菌污染多，分离难度大，很少采用。菇（耳）木分离法是利用菇（耳）木中的菌丝直接培养出菌种的一种方法。操作步骤（以银耳为例）:选出耳整齐、朵大色白、无杂菌的新段木为材料。在长有子实体的部位，横断面锯下1厘米的薄片，带入无菌室，按前述方法用升汞溶液消毒后，切去树皮，再将木片切成火柴梗粗细的小木块，将小木块放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基，每管一根，于23～25℃中培养，3～5天后，小木块上出现纤细的，由白色转浅灰色的银耳伴生菌菌丝——“香灰菌丝”，再经过7～10天，小木块上出现白色短绒状的银耳菌丝，挑取菌丝转管，进行扩大培养。10天左右，选取生长好的菌丝，在木屑培养基上鉴定，从中选取菌丝生长发育均匀，子实体原基大，且呈水晶状的作菌种。香菇、木耳等菌的菇（耳）木分离较简单，在分离的小木块上长出白色绒毛状菌丝即为该菌菌种。
菌种制作步骤 主要包括母种、原种和栽培种的制作。
母种的制作 常用的培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%)和玉米粉蔗糖琼脂培养基(玉米粉4%、蔗糖1%、琼脂2%)。培养基配制好后，装入试管，121℃下灭菌30分钟。灭菌结束后，趁热摆成斜面，冷后每管接入一小块菌丝体，置适宜温度下培养，至菌丝体布满斜面。
原种的制作 常用的培养基有木屑米糠（或麦麸）培养基(阔叶树木屑78%、米糠或麦麸20%、蔗糖1%、石膏1%、含水量58～62%)，用于木材腐生菌如香菇、木耳，金针菇等。麦草培养基(长3厘米的麦草80%、麦麸或米糠19%、石膏1%、含水量65%)，用于草腐菌，如草菇、银丝菇等。粪草培养基(畜粪49%、禾草49%、石膏1%、过磷酸钙1%、含水量65%)，用于腐殖质腐生菌，如蘑菇、双环蘑菇等。谷粒培养基(谷粒98.3%、碳酸钙0.4%、石膏1.3%)，谷粒选用小麦、高粱、谷子等均可，筛选去杂，加水浸泡后煮熟，与辅料拌匀。此培养基适用于各种食用菌。培养料配好后装瓶，于1.5～2公斤/平方厘米压力下灭菌1.5～2小时，冷却后每瓶接种1平方厘米大小的母种一块，置适宜温度下培养30～45天。
栽培种制作 栽培种的培养基同原种。配料、装瓶，灭菌、冷却后，每瓶接入适量原种(一瓶原种可接栽培种50瓶左右)，置适宜温度下培养，至菌丝体布满全瓶。香菇、木耳段木栽培也可用木块种。将适宜树种的枝条切成小木块，加适量水，与木屑、米糠、蔗糖、石膏等辅料拌匀，装瓶、灭菌后接入原种，培养至菌丝长满木块，即得木块栽培种。