细菌战剂检验

细菌战剂检验就是通过验证细菌所具有的特征来区别细菌，进行菌种的鉴定。目的在于确定战剂的种类和特点，为消毒、免疫预防和对患者的诊断治疗提供依据。由于大部分生物战剂都可通过气溶胶方式施放，在进行标本处理和初步检验时，必须考虑到各种生物战剂的可能性，因此要有一个综合检验程序，避免顾此失彼，发生漏检。
细菌类生物战剂是单细胞微生物，具有染色性和形态学特征，可用普通光学显微镜观察； 具有完全的酶系统，可在人工培养基上生长，有特定的代谢产物； 具有多种抗原结构，可用血清学试验区别；具有致病性，可引起宿主一定部位的特殊病变，引起特定的症状，可用敏感动物验证；多数可用特异性噬菌体裂解；具有特定的抗菌药物敏感谱。这些特征可作为鉴定细菌的参考。
综合检验程序，可分为快速检验和生物战剂菌种鉴定两部分（见图解）。要运用当代先进的技术方法，及时检出攻击一方可能使用的细菌、毒素、真菌等几类生物战剂，又能为衣原体，立克次体，病毒等生物战剂提供检验标本。只有鉴定到种和搞清其特点才能达到检验的目的。
快速检验指对标本中所含的生物战剂未作纯种分离鉴定之前，检查细菌的1、2项特征就可作出初步判断的检验步骤，包括显微镜检查、分离培养、鉴别培养、玻片凝集、噬菌体试验和特殊的快速检验等方法。
普通显微镜检查法是细菌检验的第一步，通过镜检可以判明标本中细菌的形态、菌量和种类，可为标本的处理和进一步检验作参考，在一定条件下按照表1即可对某

检验程序图解

*镜检包括：
1. 普通单染色标本
2. 特殊染色标本
3. 检查动力的悬滴或压片

表1 镜检特征突出的细菌战剂

细菌种类	方法及特征	可作初步判断的条件
炭疽杆菌	1.芽胞染色，直径1μm 的游离芽胞 2.荚膜染色，有荚膜， 竹节状杆菌 3.串珠试验，形成典型串 珠	气溶胶标本，芽胞占 绝对多数 脏器标本，有胶样水 肿 气溶胶和动物标本
鼠疫杆菌	美蓝染色，卵圆兼多形性 两极浓染杆菌	动物标本，特征菌占 优势
霍乱弧菌	1.复红染色，鱼贯状排列 的弧菌	病人吐泻物
	2.制动试验，流星状运动 被霍乱多价抗血清抑 制	水或水生动物的选择 增菌培养物

些病原体作出初步判断。
分离培养、噬菌体分型、玻片凝集是从标本中检出致病菌，获得细菌纯种的技术。分离培养一般是在平板培养基上，用接种环划线接种后孵育培养，由分散在固体培养基表面上的单一种类的细菌繁殖形成孤立的菌落。由于细菌的种类和使用的培养基不同，有些细菌的菌落具有可资鉴别的特征(表2)；有的细菌在种属间菌落虽然相似，但佐以玻片凝集或噬菌体试验，亦可作出对菌种的初步判断。
分离培养的同时作噬菌体试验的方法适用于含菌量大的标本。预计含菌量少的外界标本应在浓缩处理后，先接种动物或增菌培养基。一份标本要同时划两个平板。其中一个平板接种噬菌体，接种方法是用接种环沾取噬菌体和接种细菌的划线交叉划一条线。划线处经过培养没有细菌生长，或者与两侧比较菌落明显减少，生长的菌落都是杂菌，为阳性结果。
玻片凝集试验是选可疑菌落、沾取细菌和已知诊断血清在载玻片上混合，同时作生理盐水对照，前者凝集，对照不凝为阳性。
荧光抗体染色试验 是快速诊断方法。主要试剂用荧光色素标记的抗体；必要的仪器是荧光显微镜。本法适用于临床、尸检和动物标本的检查，因为这类标本中致病菌

表2 几种细菌战剂的菌落特征

细菌种类	培养基和培养时间 (37℃，小时)	菌 落 特 征					辅助试验
		大小(mm)	形状	表面	边缘	色 泽
炭疽杆菌	戊烷脒血琼脂 (12～18)	2～3	不整圆或一 侧有尾突	粗糙	*卷发状不 溶血	毛玻璃样	噬菌体
**鼠疫杆菌	龙胆紫亚硫酸钠溶 血琼脂(24—48)	0.2～0.3	*头盔状	中心致 密有颗粒	扁平，有 花边	微紫	噬菌体
土拉杆菌	普通琼脂 先锋霉素，葡萄糖 血琼脂(48)	不生长 1～2	盘状突起	光滑	整圆	灰白	玻片凝集
布氏杆菌 *类鼻疽杆菌	改良赫氏琼脂(72) 甘油琼脂(48)	0.4～0.6 1.5～3.0	圆形隆起 不整圆	光滑 皱折呈 同心圆状	整圆 不整	蜜黄色 棕黄	玻片凝集 玻片凝集
霍乱弧菌	普通碱性琼脂(18) TCBS琼脂(18)	2～3 2～3	圆形 圆形	光滑 光滑	平整 平整	透明 微黄	玻片凝集 玻片凝集
沙门氏，志贺 氏菌	SS琼脂(24) 肠道琼脂(24) (HE)	1～2 1～2	圆形 圆形	光滑 光滑	整圆 整圆	半透明 绿色（志贺氏） 蓝色带黑心	玻片凝集 玻片凝集

^**早期菌落有不同特征： 鼠疫杆菌16～18小时，用低倍显微镜可见碎玻璃状菌落。类鼻疽杆菌24小时内的菌落为光滑型，18～20小时有些菌株的菌落放大40倍，表面有马铃薯芽眼样凹陷。
^*低倍镜下的特征
常占绝对优势，而且抗原性好；由于病人服药或尸体腐败等原因，标本用培养方法不成功时，荧光抗体染色有时可获得阳性。如作生物战剂污染的或估计杂菌含量多的标本检验，最好先经选择增菌培养或经敏感动物接种以控制有类属抗原的非致病菌的交叉染色。本法可用于鼠疫杆菌、土拉杆菌等抗原性强，抗原构造简单又有形态特征的细菌，作出菌种的初步判断；用于象沙门氏菌属细菌那样抗原构造复杂，形态又和类菌属菌相似的标本，只能用多价抗血清作出菌属的初步判断。用本法检查标本悬液，在每毫升含数万到数十万个菌体细胞时可得阳性结果。
荧光抗体的制备和荧光抗体染色程序如下图解：

荧光抗体制备和染色程序图解

反向间接红细胞凝集(RPHA) 用已知抗原致敏人或动物红细胞，检出未知抗体，称为间接红细胞凝集。反之，以已知抗体致敏红细胞，检出未知抗原，称为反向间接红细胞凝集。两者的敏感性，在血清学方法中，仅次于放射免疫方法，可检出的蛋白量在1到10ng水平。本法在加好反应成份后1～2小时即可得到结果，简单、易行，适用于生物战剂检验。
试剂——抗体致敏红细胞的制备（金属离子鞣酸法）
❶ 10% 甲醛化红细胞的制备 取保存液中沉积的红细胞1份，加20份0.15M pH7.2磷酸盐缓冲液离心洗4次，加8份冷的3%甲醛pH7.2磷酸盐缓冲液，摇匀，盖上瓶盖，置于4～6℃下，经常摇动，24小时后，取出置于室温(20～22℃)中4小时，再按沉积红细胞1份加2份冷的36～38%甲醛溶液，混匀，经常摇动再放4～6℃和室温相继处理24小时。用生理盐水洗4～5次，除去游离甲醛，用生理盐水配成10%红细胞悬液，加万分之一的硫柳汞，放普通冰箱，可保存半年以上。
❷氯化铬抗体溶液：取1ml含Cr+++2～4μg的氯化铬溶液加入清洁的试管中，取2ml用pH 4.8～5.0的醋酸缓冲液稀释的抗体球蛋白(0.025mg/ml)和氯化铬溶液混合，置37℃水浴中作用10分钟备用。
❸抗体致敏红细胞的制备：取10%甲醛化红细胞0.6ml于刻度离心管中，每分钟2,500转离心3分钟，去上清液，用4ml生理盐水，以同上的转速和时间洗两次，取沉积红细胞和氯化铬抗体溶液3ml混合均匀后加万分之一硫柳汞溶液1 ml，再充分混匀，置37℃水浴15分钟致敏，离心去上清，用1%正常兔血清盐水4ml离心洗两次，最后加2ml 1%正常兔血清盐水配成3%的抗体致敏红细胞备用。如冷冻干燥，置4℃保存，有效期2～3年。
❹用正常兔血清γ-球蛋白代替抗体球蛋白致敏红细胞，用作试验对照。
微量试验法 将待检标本制成生理盐水悬液，作定量试验时，每份标本稀释两排孔，一排加抗体致敏诊断红细胞，一排加对照红细胞。每批试验至少用和诊断红细胞对应的已知抗原作一次诊断效果的确定，作一次稀释液的对照。微量法用V型孔微量血清盘作试验，用0.025ml容积的不锈钢稀释棒稀释，每孔含倍比稀释的标本0.025ml，将稀释完了的血清盘置振荡器上，边振荡边滴加等量致敏的诊断和对照红细胞，混匀后取下，置室温或37℃2小时判定结果。判定结果的标准如上图：
本法与荧光抗体法相反，容易受临床或尸检标本的组织成份干扰出现假阳性，但直接从染菌的外界标本洗液中检出目的菌的效果比荧光抗体法好，因此，作为快速检验方法可和荧光抗体法配合使用。
用此法从染毒土壤浸液中检出肉毒毒素，不受干扰，可得典型的结果。
用平行对照法可从组织标本中检出鼠疫杆菌、土拉杆菌，因为这些细菌在病变组织中含量大，只要试验稀释液系列的阳性孔多于对照两孔以上，即可作诊断。本法的敏感性视致敏红细胞的状态而有所不同，致敏的新鲜红细胞最敏感，但不适于长期保存使用，致敏的甲醛红细胞次之，干燥甲醛红细胞最不敏感，但适于贮存和携带使用。以冻干甲醛红细胞为例，其检出阳性对照抗原的敏感界限，按检样每ml含菌数计，鼠疫杆菌、土拉杆菌、类鼻疽杆菌为10⁶；炭疽杆菌芽胞为1.6×10⁶；布氏杆菌为2.5×10⁷；霍乱弧菌5×10⁷；肉毒毒素0.04μg。其绝对检出量以微量法计算，应为以上数值的1/40。

反向间接红细胞凝集试验