磷酸二酯法和磷酸三酯法

在化学合成时，如果是用只是碱基和羟基被保护的核苷酸为磷酸组份同另一核苷的羟基反应，生成的中间产物为3′-5′磷酸二酯，称之为磷酸二酯法(图1)。如果是用磷酸上也有一个保护基的核苷酸二酯作为磷酸组份，生成的中间产物为磷酸三酯，这种合成方法称之为磷酸三酯法。
磷酸二酯法所用的缩合剂为二环已基碳二亚胺和芳基磺酰氯。这是Khorana实验室于50年代建立和发展起来的一个早期的经典方法。Khorana等人于1956年首先用这个方法合成了二脱氧胸苷-磷酸(TpT)，然后在1957～1965年间合成了一系列由一种、二种或三种单核苷酸组成的具有交替重复顺序的最长达16聚的脱氧寡核苷酸片段和64种可能的三核苷二磷酸，并以合成的脱氧寡核苷酸片段为模板，借助DNA聚合酶和RNA聚合酶复制或转录，得到具有对应重复顺序的长链人工mRNA，然后再通过在无细胞体系中的翻译表达，对确定氨基酸的密码作出了重大贡献。

图1 寡核苷酸的磷酸二酯法合成
B₁,B₂为胸腺嘧啶、尿嘧啶和带保护基的碱基。R¹,R²,R³,R⁴为保护基。

磷酸二酯法是在50年代至70年代中期广为采用的方法。我国科学工作者王德宝等在合成酵母丙氨酸转移核糖核酸中的RNA小片段时也曾经采用了这个方法。使用磷酸二酯法的最成功的例子是Khorana 等人用这个方法合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸结构基因 ^*和大肠杆菌酪氨酸校正转移核糖核酸前体基因中的全部化学片段，最长的合成片段达到二十核苷酸。
由于磷酸二酯法合成的中间产物具有一个未被保护的核苷酸间磷酸羟基，它可能导致多种副反应而致产率随着链长的增加急剧下降，合成的产物在分离鉴定上也相当烦琐和费时。改进的方法是将核苷酸间的磷酸羟基也保护起来。为此，核酸化学家们又开始对Todd等人早期的磷酸三酯法进行研究改进，从而创立了新的改良磷酸三酯法(图2)。

图2 寡核苷酸的磷酸三酯法合成
B₁,B₂为胸腺嘧啶、尿嘧啶和带保护基的碱基。R¹,R2和Ar为保护基，R为H或OR³(R³为保护基)

磷酸三酯法除吸取了磷酸二酯法中较好的羟基和氨基保护基外，还发展了易于导入和脱除的核苷间磷酸保护基（邻氯苯基或对氯苯基），并找到了能活化二酯型磷酸而副反应较少的高效缩合剂。最常用的是2,4,6-三甲基苯磺酰硝基三唑(MsNT)。核苷间的磷酸被保护以后，产物的极性下降，不仅可以用氯仿萃取分离，而且可以用快速的硅胶短柱层析来分离纯化，从而大大提高了合成速度。改进后的磷酸三酯法具有比磷酸二酯法副反应少、产率高、速度快和分离纯化简便等优点。这些优点还使它能适用于固相合成，从而为合成的自动化创造了条件。
利用改良的磷酸三酯法，一系列的多肽或蛋白质基因，如人胰岛素A、B链和人胰岛素原的基因，干扰素基因以及人生长激素基因等的组成片段都被很快地合成。我国科学工作者汤锦炎等人在合成脑啡肽基因时也采用了这个方法。这一改进也大大加速了RNA的合成。最近，大塚等人用磷酸三酯法合成了大肠杆菌甘氨酸转移核糖核酸5′半分子的三十三核苷酸。