病毒战剂鉴定

病毒战剂鉴定，系在病毒分离的基础上用病毒学方法，准确地确定病毒战剂的种类和性质。
将待检标本分为2份，一份冻存，另一份按下列步骤进行鉴定。
(1) 鉴定新分离的因子是否为病毒： 为此，应作以下试验：
传代试验： 在适宜的宿主系统中，至少传代三次。新分离因子如为病毒，应能规律地传代。肉毒毒素等细菌毒素，则不能增殖。
过滤试验： 如新分离因子是病毒，应能通过除菌滤膜或除菌滤器。但支原体、衣原体和细菌L型也能通过除菌滤膜或滤器，故应结合其他试验的结果，综合判定。
无菌试验： 如新分离因子是病毒，应不能在细菌、支原体、真菌或噬菌体的培养基内生长。但衣原体和立克次体也不能在这些培养基内生长，故必须综合其他试验结果进行判断。
抗生素试验：如新分离因子是病毒，应能耐受抗生素处理。衣原体也能通过除菌滤器，但不能耐受抗生素处理。如新分离因子符合上述4项试验中的病毒特征，可认为新分离因子是病毒。
(2)将新分离病毒鉴定到科： 将未知病毒正确地鉴定到科应包括基因组核酸特征，结构蛋白和非结构蛋白，其他化学组成，病毒颗粒理化特征，形态和形态发生的特征，抗原特征及动物试验等。可通过以下3项试验进行鉴定：
核酸型测定： 按照工作条件，选作区分病毒DNA和RNA的试验，以鉴别新分离病毒是DNA病毒还是RNA病毒。
乙醚敏感性试验： 用乙醚处理新分离病毒，再滴定其感染滴度，如滴度降低1.5～2log 10，可以认为新分离病毒对乙醚敏感。
病毒颗粒的形态和大小： 可作负染色标本或超薄切片，用直接电镜法观察新分离病毒的形态学特征。
综合上述3项试验的结果，参照表1所示，可将新分离病毒初步归入4个科和2种未分类的战剂内，或判断为非战剂病毒。
(3) 初步鉴定到属或群： 如已将新分离病毒初步鉴定到科，可再作某些试验，继续将其初步鉴定到属或群，使用的鉴定方法，各科有所不同。
披膜病毒科(Togaviridae): 本科有4个属，其中只有甲病毒属(Alphavirus)和黄病毒属(Flavivirus)含有病毒战剂。鉴别这两个属的方法是作血凝抑制试验和测定病毒颗粒的大小。
血凝抑制试验： 甲病毒属和黄病毒属之间，无血凝抑制试验的交叉反应。因此，可以使用这两个属的广谱诊断

表1 主要病毒战剂“科”的鉴定

病毒 核酸型	对乙醚的 敏感性	病毒颗粒形态大小 (nm)	病毒战剂 （科）
DNA	耐受	方砖形 300～450×170～260	痘病毒科
	敏感	其它情况	非战剂病毒
RNA	敏感	球形，40～70 球形，80～110	披膜病毒科 布尼亚病毒科
		多形态，内含特殊 颗粒，50～300	沙粒病毒科
		粗长杆形或扭曲奇形 长2,600或更长	马尔堡病毒 伊博拉病毒
	耐受	其它情况	非战剂病毒

血清（属特异免疫血清），分别和新分离病毒作血凝抑制试验，即可将新分离病毒初步归入甲病毒属或黄病毒属。病毒颗粒大小： 甲病毒属成员的病毒颗粒直径为70nm左右，黄病毒属则为40～50nm。
痘病毒科(Poxviridae): 本科有2个亚科，即脊索痘病毒亚科 (Chordopoxvirinae)和昆虫痘病毒亚科(Ento-mopoxvirinae)。在脊索痘病毒亚科中，共包含6个属，其中正痘病毒属(Orthopoxvirus)的一个成员——天花病毒是病毒战剂。在整个痘病毒科中，仅有正痘病毒属的成员能产生血凝素（具有血凝活性）。这种血凝素是一种脂蛋白，能和病毒颗粒分开。因此，如已将新分离病毒初步鉴定到痘病毒科，只要进一步鉴定它是否为正痘病毒属成员即可。鉴定的方法是： 将新分离病毒进行增殖培养，取其细胞外培养液作血凝试验即可。必需注意，在作血凝试验以前，应预先选择适用的鸡红细胞，因为并非每只鸡的红细胞都合用。
沙粒病毒科(Arenaviridae): 本科只有一个属，即沙粒病毒属 (Arenavirus)。拉沙病毒即为这个属的成员。如已将新分离病毒初步鉴定到沙粒病毒科，则可直接向属以下鉴定，即直接鉴定是否为拉沙病毒。
布尼亚病毒科(Bunyaviridae): 本科是1976年新建立的一个大科，其成员总数已超过200个。按照国际病毒分类委员会(ICTV)1981年通过的病毒新分类法，布尼亚病毒科已建立4个属，另有未建属的7个血清群以及尚未划分为“群”的10种病毒。已建立的4个属是： 布尼亚病毒属(Bunyavirus)，内罗病毒属(Nairovirus)，白蛉病毒属(Phlebovirus)，乌库病毒属(Uukuvirus)。裂谷热病毒就是白蛉病毒属的一个“种”，近年来，对本科的分子生物学特征和血清学反应作了深入的对比研究。上述4个属的详细鉴别，应依据这些对比研究资料。但就病毒战剂检验来看，如已将新分离病毒初步归入布尼亚病毒科，则可先用血清学方法，进一步鉴定新分离病毒是否为白蛉病毒属的成员，然后再鉴定是否为裂谷热病毒。为此，可用本属成员的诊断血清和新分离病毒作血凝抑制试验或免疫荧光抗体检测。如新分离病毒和这两种试验中的诊断血清有普遍的交叉反应，则可认为新分离病毒是白蛉病毒属的成员。
(4) 病毒战剂属以下的鉴定： 病毒战剂属以下的鉴定，当前主要依据其血清学试验，故应同时注意病毒的血清学等级及其病毒分类学位置。
常规使用的三种血清学试验是： 血凝抑制试验，补体结合试验，中和试验。近年来逐渐完善的空斑减少中和试验(PRNT)显然比小鼠脑内中和试验要更特异、简便、快速、安全，故应优先使用这种中和试验。1969年建立的“动力血凝抑制试验”(KHI test)能够更详细地划分抗原、抗体的同源性程度，可用于病毒战剂属以下的鉴定。近年来，酶联免疫吸附测定法(ELISA)也已开始用于某些病毒战剂的检验。
不论常规血清学试验或新建立的血清免疫学检测法，它们在不同病毒科、属内所起的鉴定效果，均有所不同，例如：
甲病毒属： 本属目前共有23个成员，其中东马病毒、西马病毒，委马病毒是可能的病毒战剂，甲病毒属的各成员之间均有显著的血凝抑制试验交叉反应，但可用中和试验鉴别。如已将新分离病毒鉴定为甲病毒属成员，则应再使用各成员的各种异诊断血清作中和试验，即可作出“种”的鉴定。但即使作中和试验，本属各成员间也有不同程度的交叉中和反应。根据这种交叉中和反应，已将甲病毒属成员划分为6个血清学亚群或称为血清复合体。血清学等级的血清复合体相当于分类等级的亚属。在进行实际鉴定时，应将这6个复合体的代表性诊断血清包括在内，以便不仅能鉴定是否为上述3种病毒战剂之一，而且可初步鉴定为3种战剂以外的何种病毒。
黄病毒属： 本属目前共有54个成员，其中黄热病病毒，登革病毒和森林脑炎病毒是可能的病毒战剂，黄病毒属各成员之间的血凝抑制交叉反应更显著，更广泛，但仍然可用中和试验明确区别各个成员。本属有7个血清学亚群，可参照上述甲病毒属中所述的方法进行鉴定。
正痘病毒属： 本属目前共有8个成员，其中天花病毒是病毒战剂。本属的另外2个成员： 猴痘病毒和痘苗病毒，其抗原结构和天花病毒有相似处。全球消灭天花后，猴痘病毒日渐重要，必须鉴别天花病毒和猴痘病毒。此种鉴别可分2步进行。第一步，先用痘苗病毒诊断血清和新分离病毒作补体结合试验及琼脂凝胶扩散试验。如出现阳性反应，可认为新分离病毒是痘苗，猴痘或天花病毒中的一种。第二步，将新分离病毒、猴痘病毒和痘苗病毒

表2 最高温度培养试验

病 毒	病 毒 增 殖
	37℃	39℃	39.5℃
痘苗病毒 猴痘病毒 天花病毒	+ + +	+ + -	+ - -

+: 出现病灶，-: 不出现病灶
分别接种于鸡胚绒毛尿囊膜，放在37℃,39℃及39.5℃下孵育，密切观察是否有病毒繁殖，参照表2作出鉴别，此即为最高温度培养试验。
由表2可知，天花病毒在39℃或39.5℃均不能增殖，可据此作出鉴定。
拉沙病毒： 新病毒如已初步鉴定为沙粒病毒科成员，可直接鉴定是否为拉沙病毒即可。使用免疫荧光法或补体结合试验，可明确地将拉沙病毒和本属其他成员区别开来。免疫荧光法尚可用于早期检出拉沙病毒抗原或作抗体滴定，效果良好，已广泛使用。
白蛉病毒属： 本属共有30个成员。裂谷热病毒即为本属的一个“种”。本属各个成员之间有广泛的血凝抑制交叉反应。免疫荧光法的交叉反应更为显著，但可使用空斑减少中和试验(PRNT)鉴别本属的各个成员。如已将新分离的病毒鉴定为白蛉病毒属成员，则可用PRNT鉴定是否为裂谷热病毒。补体结合试验和琼脂凝胶扩散试验也可进行同样水平的鉴定，但敏感性均次于PRNT。必需注意，当分离出病毒战剂并加以鉴定后，应从原阳性标本中进行该病毒战剂的再分离和再鉴定，以增强整个检验工作的科学性。
马尔堡病毒和伊博拉病毒目前尚未确定其病毒分类位置。