着色剂的测定

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1．原理

水溶性酸性染料在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性、定量。最低检出量为50μg，点样量为1g，样品最低检出浓度约为50mg／kg。

2．试剂

(1)聚酰胺粉(尼龙6)：200目。置60～80℃，活化1h后，放干燥器中备用。

(2)硫酸：1∶10。

(3)甲醇－甲酸溶液：6∶4。

(4)甲醇。

(5)20%柠檬酸溶液，调节pH用。

(6)10%钨酸钠溶液。

(7)石油醚：沸程60～90℃。

(8)海砂：先用1∶10盐酸煮沸15min，用水洗至中性，再用5%氢氧化钠溶液煮沸15min，用水洗至中性，再于105℃干燥，贮于具玻璃塞的瓶中，备用。

(9)乙醇－氨溶液：取1mL氨水，加70%乙醇至100mL。

(10)50%乙醇溶液。

(11)硅胶G。

(12)pH6的水：用20%柠檬酸调节pH至6。

(13)盐酸：1∶10。

(14)5%氢氧化钠溶液。

(15)碎瓷片：处理方法同本测定方法2．(8)。

(16)展开剂。

①正丁醇∶无水乙醇∶1%氨水(6∶2∶3)：供纸色谱用。

②正丁醇∶吡啶∶1%氨水(6∶3∶4)：供纸色谱用。

③甲乙酮∶丙酮∶水(7∶3∶3)：供纸色谱用。

④甲醇∶乙二胺∶氨水(10∶3∶2)：供薄层色谱用。

⑤甲醇∶氨水∶乙醇(5∶1∶10)：供薄层色谱用。

⑥2．5%柠檬酸钠∶氨水∶乙醇(8∶1∶2)：供薄层色谱用。

(17)色素标准溶液(以下商品作为标准以100%计)。

胭脂红：纯度60%；苋菜红：纯度60%；柠檬黄：纯度60%；靛蓝：纯度40%；日落黄：纯度60%；亮蓝：纯度60%。

准确称取上述色素各0．100g，用pH为6的水溶解，移入100mL容量瓶中并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1mg商品色素。靛蓝溶液需在暗处保存。

(18)色素标准使用液：临用时吸取色素标准溶液各5．0mL，分别置于50mL容量瓶中，加pH为6的水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0．1mg商品色素。

3．仪器

(1)分光光度计。

(2)微量注射器或血色素吸管。

(3)展开槽：25cm×6cm×4cm。

(4)层析缸。

(5)滤纸：中速滤纸，纸色谱用。

(6)薄层板：5cm×20cm。

(7)电吹风机。

(8)水泵。

4．操作方法

(1)样品处理：

如含蛋奶的制品(蛋糕类)：称取10．0g粉碎均匀的样品，加海砂少许，混匀，用热风吹干样品(用手摸已干燥即可以)，加入30mL石油醚搅拌，放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理3次，以除去脂肪，吹干后研细，全部转入G₃垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇－氨溶液提取色素，直至色素全部提完，置水浴下浓缩至约20mL立即用1∶10硫酸调溶液至微酸性，再加1．0mL 1∶10硫酸，加1mL 10%钨酸钠溶液，使蛋白质沉淀过滤，用少量水洗涤，收集滤液。

(2)吸附分离：将处理后所得的溶液加热至70℃，加入0．5～1．0g聚酰胺粉充分搅拌，用20%柠檬酸溶液调pH至4，使色素完全被吸附，如溶液还有颜色，可以再加一些聚酰胺粉。将吸附色素的聚酰胺全部转入G₃垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤(如用G₃垂融漏斗过滤，可以用水泵慢慢地抽滤)。用20%柠檬酸酸化至pH4的70℃水反复洗涤，每次20mL，边洗边搅拌，若含有天然色素，再用甲醇－甲酸溶液洗涤1～3次，每次20mL至洗液无色为止。再用70℃水多次洗涤至流出的溶液为中性。洗涤过程中必须充分搅拌。然后用乙醇－氨溶液分次解吸全部色素，收集全部解吸液，于水浴上驱氨。如果为单色，则用水准确稀释至50mL，用分光光度法进行测定。如果为多种色素混合液，则进行纸色谱或薄层色谱法分离后测定，即将上述溶液置水浴上浓缩至约2mL后移入5mL容量瓶中，用50%乙醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中并稀释至刻度。

(3)定性：

①纸色谱：取色谱用纸，在距底边2cm的起始线上分别点3～10μL样品溶液、1～2μL色素标准溶液，挂于分别盛有2(16)①，2(16)②的展开溶剂的层析缸中，用上行法展开，待溶剂前沿展至15cm处，将滤纸取出于空气中晾干，与标准斑比较定性。

也可取0．5mL样液，在起始线上从左到右点成条状，纸的右边点色素标准溶液，依法展开，晾干后先定性后供定量用。靛蓝在碱性条件下易退色，可用2(16)③展开剂。

②薄层色谱：

a．薄层板的制备：称取1．6g聚酰胺粉，0．4g可溶性淀粉及2g硅胶G，置于合适的研钵中，加15mL水研匀后，立即置涂布器中铺成厚度为0．3mm的板。在室温晾干后，于80℃干燥1h，置干燥器中备用。

b．点样：离板底边2cm处将0．5mL样液从左到右点成与底边平行的条状，板的右边点2μL色素标准溶液。

c．展开：苋菜红与胭脂红用2(16)④展开剂，靛蓝与亮蓝用2(16)⑤展开剂，柠檬黄与其他色素用2(16)⑥展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待色素明显分开后取出，晾干，与标准斑比较，如比移值相同即为同一色素。

(4)定量：

①样品测定：将纸色谱的条状色斑剪下，用少量热水洗涤数次，洗液移入10mL比色管中，并加入水稀释至刻度，做比色测定用。

将薄层色谱的条状色斑包括扩散的部分，分别用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇－氨溶液解吸色素，少量反复多次至解吸液无色，收集解吸液于蒸发皿中，于水浴上挥去氨，移入10mL比色管中，加水至刻度，做比色用。

②标准曲线制备：分别吸取0．0、0．50、1．0、2．0、3．0、4．0mL胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄色素标准使用液，或0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0mL亮蓝，靛蓝色素标准使用溶液，分别置于10mL比色管中，各加水稀释至刻度。

上述样品与标准管分别用1cm比色杯，以零管调节零点，于一定波长下(胭脂红510nm，苋菜红520nm，柠檬黄430nm，日落黄482nm，亮蓝627nm，靛蓝620nm)，测定吸光度，分别绘制标准曲线比较或与标准色列目测比较。

(5)计算：

式中 x——样品中色素的含量(g／kg或g／L)；

A——测定用样液中色素的含量(mg)；

m——样品的质量(体积)［g(mL)］；

V₁——样品解吸后总体积(mL)；

V₂——样液点板(纸)体积(mL)。

5．注意事项

(1)提取样品及纯化色素的过程中，靛蓝在碱性溶液中容易被破坏退色，除注意尽快用乙酸调节pH为6外，可改用0．1%～0．5%氨水溶液提取和解吸。

(2)展开时应根据同时存在的几种色素选择展开剂，例如使用展开剂时②苋菜红与胭脂红的比移值比较接近，用展开剂④可将两者很好地分开；使用展开剂①时柠檬黄和靛蓝不易展开，展开剂⑥可将两者很好地分开。

(3)靛蓝在碱性溶液中容易分解，可用异丁醇∶无水乙醇∶水(3∶2∶2)展开。

(4)样品实验前要提纯，以免影响吸附及层析分离效果。用酸性热水洗去食盐、糖、香精等，石油醚洗涤脱脂，蛋白酶去蛋白。

(5)层析用的溶剂不可存放太久，否则浓度和极性变化，影响分离效果，最好2d换一次。

(6)比色液要求清晰，混浊液要放过置过夜，离心过滤等处理后比色。