镰刀菌毒素对食品污染

镰刀菌在自然界分布很广，也是常见侵染田间谷物、仓库贮粮和饲料的霉菌菌属之一。已发现有不少种镰刀菌寄生谷物、贮粮和饲料后，于一定条件下产生多种镰刀菌毒素，到目前为止，已发现十多种属单端孢霉烯族化合物的镰刀菌毒素以及玉米赤霉烯酮和丁烯酸内酯。
玉米赤霉烯酮(F-2雌性发情毒素) 1928年，McNutt等首次报道猪饲喂发霉玉米饲料后，即引起外阴和乳房肿胀，严重时伴有阴道外翻和子宫脱垂，且发现怀孕雌猪食入发霉饲料后引起流产，甚至经阉割的雄猪可导致包皮增长和乳腺突起和红肿。实验证明，从发霉玉米中分出的禾谷镰刀菌（有性世代为玉米赤霉）的代谢产物是引起猪雌性发情综合症状的原因。Urry等(1966)将此代谢产物命名为玉米赤霉烯酮。
物理和化学特性： 玉米赤霉烯酮是一种白色结晶； 分子式为C₁8H₂₂O₅；分子量为318；熔点为164～165℃; 紫外线光谱最大吸收为236nm(ε29,700)、274nm(ε13,900)和316nm(ε6020)；红外线光谱最大吸收为970cm^-1。纯玉米赤霉烯酮不溶于水、二硫化碳和四氯化碳；溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、醋酸乙酯、乙腈和乙醇；微溶于石油醚(沸点30～60℃)。Urry等首先确定了玉米赤霉烯酮的化学结构式(见图1)，目前已知的玉米赤霉烯酮衍生物至少有15种。
产霉菌株及其形态特征： 禾谷镰刀菌属于镰刀菌属色变组中的一个种。此菌在马铃薯葡萄糖琼脂上气生菌丝生长良好，呈棉絮状至丝状，白色或紫红色。基质亦呈紫红色。大分生孢子生长于分生孢子座和粘分生孢子团内。纺锤-镰刀形，呈椭圆形弯曲。顶端细胞均匀地逐渐变细，基部有明显的足细胞，典型的具5隔，很少具3隔和更多的隔(图2)。此菌大多无厚垣孢子。但偶而可发现个别菌株产生，多为间生。菌核呈各种深浅不一的紫红色、暗紫红色和鲜明玫瑰色或无。

图1 玉米赤霉烯酮

图2 禾谷镰刀菌

a.大分生孢子 b.子囊壳 c.子囊和子囊孢子

毒性：玉米赤霉烯酮的毒性对猪最为敏感。急性中毒试验中，6周龄的小母猪每天投给5mg玉米赤霉烯酮，饲喂5d,5～7d内即可出现外阴、乳房和乳头肿大、阴道脱垂、子宫肿大和卵巢萎缩，但停食后即可恢复正常。亚慢性中毒剂量可使猪不育、产仔猪数减少、仔猪体弱或产后死亡；存活的雄性小猪有睾丸萎缩、乳腺肿大等雌性化影响。怀孕雌猪于最后1个月怀孕期，每天注射玉米赤霉烯酮5mg，出生的仔猪出现死胎和“斜腿”，系玉米赤霉烯酮对仔胎病理影响所致。玉米赤霉烯酮尚可导致大鼠胎鼠骨胳畸形。
检验方法：
❶提取和纯化：霉菌侵染的谷粒粉碎后，用水和氯仿混合液在高速搅拌器中提取，过滤后将氯仿提取液添加在硅胶柱上进行层析，用正己烷，苯和苯-丙酮(95:5)洗脱，洗脱液蒸发至干，残渣溶于1ml苯中备作薄层层析用。
❷薄层层析： 取玉米赤霉烯酮提取物滴加在硅胶G薄层板上，用氯仿-乙醇(95:5)展开后，置紫外线灯(365nm) 下检查，可见蓝-绿色荧光样点，Rf值为0.50。用50%硫酸甲醇溶液喷雾处理，样点立刻变为淡绿色，然后很快变成黄色。若经100℃加热10min，即变成黄褐色。
单端孢霉烯族化合物 目前从自然产物提纯鉴定的单端孢霉烯族化合物已有20余种。其中由镰刀菌产生的此类毒素约10余种。
物理和化学特性： 单端孢霉烯族化合物的基本化学结构为一拟倍半萜烯结构，在C-12,13位置上有一环氧基和C-9,10位置上有一双键，故称12,13-环氧单端孢霉烯族化合物。上野(1973)按照其化学结构在C-8位置上的变化，将其分为两大类。即A型和B型(图3)。几种主要镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物的物理和化学特性见表1。这些天然产物的单端孢霉烯族化合物为无色结晶。具有旋光性，一般能溶于中等极性的有机溶剂，微溶于水，化学性能很稳定。在实验室条件下长期贮存不变，用正常的烹调方法不易破坏。

图3 单端孢霉烯族镰刀菌毒素

注： A型	R1	R2	R3	R5
二醋酸藨草镰刀菌烯醇 T2毒素 新茄病镰刀菌烯醇 HT2毒素	OH OH OH OH	OAc OAc OAc OH	OAc OAc OAc OAc	H OCOCH2CH(CH3)2 OH OCOCH2CH(CH3)2
B型	R1		R2		R3	R4
雪腐镰刀菌烯醇 镰刀菌烯酮-X 二醋酸雪腐镰刀菌烯醇	OH OH OH		OH OAc OAc		OH OH OAc	OH OH OH

表1 单端孢霉烯族镰刀菌毒素的物理和化学特性

特 性	A 型			B 型
	二醋酸藨草镰刀菌烯醇	T2毒素	新茄病镰刀菌烯醇	雪腐镰刀菌烯醇	镰刀菌烯酮-x	二醋酸雪腐镰刀菌烯醇
熔点(℃) 分子量 分子式 UVmax(nm)	162～164 366.17 C19H26O7 最终吸收	151～152 466.51 C24H34O9 最终吸收 (CCI4)	171～172 382.16 C19H26O8 最终吸收	222～223 312.3 C15H20O7 218(CH3OH)	91～92 354 C17H22O8 220(CH3OH)	135～136 396 C19H24O9 220(CH3OH)
IR C=O(cm-1)		1720～1240 1635	—— 1735～1250	1680～1610 ——	1720 1680	1735 1680
[a]24D(C2H5OH)	-27°			+21.5°	+56.1°	+64.3°

图4 梨孢镰刀菌

a.小分生孢子 b.大分生孢子 c.厚垣孢子(单细胞和成串，间生)

图5 拟枝孢镰刀菌

a.小分生孢子 b.大分生孢子 c.厚垣孢子(间生，成串)

图6 三线镰刀菌

a.小分生孢子 b.大分生孢子 c.厚垣孢子(间生，成串)

图7 藨草镰刀菌

a.大分生孢子 b.厚垣孢子（结节状和成串间生）

图8 茄病镰刀菌

a.小分生孢子和假头状着生状态 b.大分生孢子 c.厚垣孢子（单细胞顶生和双细胞或短链状间生）

图9 雪腐镰刀菌

a.大分生孢子 b.子囊壳 c.子囊和子囊孢子

表2 产生单端孢霉烯族化合物的主要镰刀菌形态特征

菌种名称	所属组别	菌落	颜 色	小分生孢子	大分生孢子	厚垣孢子	所产毒素
梨孢镰刀菌 (图4)	枝孢组	蛛丝状 絮状	白色，黄色 或红～褐色	卵形，球形，纺 锤～椭圆形，极 少梨形	弯镰刀形，有脚 胞，1～3隔，较短	间生，成串，或 结节状	T2毒素 HT2毒素
拟枝孢镰刀菌 (图5)	枝孢组	棉絮状	白色，白～ 玫瑰色或红色	球形，梨形，椭 圆形近披针形， 近镰形	镰刀形，有脚胞， 3～5隔	间生，成串，或 结节状	T2毒素 HT2毒素
三线镰刀菌 (图6)	枝孢组	棉絮状	白色，洋红 色，红色至紫 色	梨形或柠檬 形，卵形～椭圆 形，近披针形	弯镰刀形，脚胞 明显，3～5隔	间生，成串	T2毒素
木贼镰刀菌 (图7)	膨孢组	絮状	白色，浅橄 榄色至黄褐色	无	窄镰刀形，呈抛 物线弯曲，顶端细 胞逐渐狭细，中部 细胞膨大，脚胞明 显，5～7隔	间生，成串或 结节状，偶而顶 生壁光滑至粗糙	二醋酸藨草镰刀 菌烯醇
茄病镰刀菌 (图8)	马特组	絮状 粉状	浅灰～白色 至褐色	假头着生，椭 圆形，卵形	腊肠形或纺锤- 镰刀形，顶端细胞 钝圆，脚胞不明显， 呈乳突状，3～5隔	顶生及间生有 时偶尔呈短串	新茄病镰刀菌烯 醇
雪腐镰刀菌 (图9)	蛛丝组	疏松或 纤维状	白色，玫瑰 ～苍白色，黄 色至褐色	无	纺锤-镰刀形，顶 端尖，基部楔形，无 脚胞，1～3隔	无	雪腐镰刀菌烯 醇，镰刀菌烯醇- X，二醋酸雪腐镰 刀菌烯醇

毒性： 二醋酸藨草镰刀菌烯醇对实验动物具有强烈毒性。大鼠经腹腔注射或经口灌喂可引起体腔严重水肿和明显的造血器官中毒。用含有5和15μg/ml T2毒素的饲料灌喂大鼠，3周后即出现严重生长障碍和鼻口周围炎。用295kg小牛进行实验，每天肌肉注射30mg纯T2毒素。在实验期间即出现体重下降。于第65d死亡，尸检发现内脏出血。镰刀菌烯酮-X和雪腐镰刀菌烯醇对动物皮肤刺激性很大，可导致以细胞退化为特征的辐射病样损伤以及骨髓、胸腺、肠粘膜、卵巢和睾丸的核破裂。检验方法： 各种单端孢霉烯族镰刀菌毒素，经提取后均可用薄层层析法进行鉴定(见表3)。
丁烯酸内酯 丁烯酸内酯是导致牛烂蹄病的一种毒素。牛饲喂染菌带毒的饲草后，一个月左右即出现后腿变瘸。蹄和皮肤联结处破裂。有时脱蹄及引起耳尖及尾尖干性坏死。此病具有季节性，大多发生于寒冷季节。物理和化学特性： 其化学结构式见图10，分子式为C6H7NO3，分子量为138，熔点为116～118.5℃。〔IR(KBr)呈现3315 (N-H)、3100 (C=0)、1760和1740(内酯C=0)、1695(酰胺C=0)和1520(酰胺C=OII)cm-1。UVmax为202(CH3OH,ε=11,300)〕。易溶于水，微溶于二氯甲烷和氯仿，不溶于四氯化碳，在碱性水溶液中极易水解。其水解产物为顺式甲酰丙烯酸和乙酰胺。
产毒霉株：三线镰刀菌、梨孢镰刀菌、拟枝孢镰刀菌和雪腐镰刀菌均能产生大量的丁烯酸内酯。此外，木贼镰刀菌、半裸镰刀菌和砖红镰刀菌也能产生此种毒素。

图10 丁烯酸内酯

表3单端孢霉烯族化合物的薄层层析

霉菌毒素	Rf溶剂系统					喷雾处理后的颜色
	CM	EH	BA	CPE	CEE	可见光	紫外线 (365nm)
A型：
T2毒素 二醋酸藨草 镰刀菌烯醇	0.55 0.43	0.61 0.47	0.56 0.51	0.68 0.46	0.78 0.68	灰色 灰色	天蓝色 天蓝色
新茄病镰刀 菌烯醇	0.22	0.15	0.34	0.25	0.32	灰色	天蓝色
HT2毒素	0.20	0.10	0.30	0.17	0.23	灰色	天蓝色
B型：
雪腐镰刀菌 烯醇	0.02	0.05	0.10	0.01	0.04	褐色	天蓝色
镰刀菌烯酮 -X	0.17	0.31	0.41	0.21	0.32	褐色	天蓝色
二醋酸雪腐 镰刀菌烯醇	0.43	0.47	0.51	0.43	0.54	褐色	天蓝色

注： CM=氯仿-甲醇(95:5); EH=醋酸乙酯-正己烷(3:1);BA=苯-丙酮(3:2);CPE=氯仿-异丙醇-醋酸乙酯(95:5:5)CEE=氯仿-乙醇-醋酸乙酯(90:5:5)

毒性： 丁烯酸内酯可引起家兔的皮肤反应。对小鼠的LD₅₀，经口为275mg/kg（体重）；经腹腔注射为43.6mg/kg（体重）。用纯丁烯酸内酯作小母牛肌肉注射，90d后可出现尾尖坏死和脱落。
检验方法：
❶提取： 在培养液中加1%活性炭(W/V)互相混合置于冷室内。偶而加以振摇，过夜后，用滤纸滤出炭末。然后将炭末浸泡于10倍体积的热甲醇中，移出不溶物。浓缩黄色甲醇液至褐色，再加5倍体积的氯仿至甲醇液中，除去黄色的沉淀物，剩下的甲醇-氯仿溶解层蒸发至干，即可获得粗制毒素。
❷薄层层析： 将丁烯酸内酯溶液滴加在硅胶G薄层板上。用氯仿-甲醇(9:1)展开，Rf值为0.38，用2,4-二硝基苯肼喷雾处理，然后100℃加热8～20min，呈现黄色斑点。