透射电子显微镜检术transmission electron microscopy

利用透射电子显微镜（简称透射电镜） 对样品的超微形态结构进行观察的现代科学研究手段。透射电镜的结构与工作原理 透射电镜是一种以电子束为照明源，电磁透镜成像，并配以特殊机械装置和高真空技术的大型精密电子光学仪器。由电子透镜系统、真空系统及电源系统组成(图1)。

图 1 透射电镜结构示意图

1. 灯丝； 2. 栅极；3. 阳极；4. 电子束平移倾斜线图；5. 第一聚光镜； 6. 第二聚光镜； 7. 聚光镜活动光阑；8. 样品杆； 9. 物镜活动光阑； 10. 物镜； 11. 第一中间镜；12.第二中间镜；13.投影镜； 14. 观察窗； 15. 荧光屏； 16. 照相室

电子透镜系统 即镜筒，是电镜的主体，起着成像与放大作用。由照明、成像及观察记录装置组成。
照明装置 由电子枪和聚光镜组成，产生足够强的、高度稳定的照明电子束。电子枪位于镜筒的顶部，由阴极、栅极和阳极组成。阴极（灯丝）通电加热时，产生热电子发射，形成照明电子束。阳极处于零电位，与阴极的负电位形成一电位差，称为加速电压(一般为50～100kV)。阴极发射的电子束在加速电压作用下得到加速。栅极位于阴极和阳极之间，是一个中央有小孔的圆筒，它相对于阴极-100～-500V，起着控制电子发射及改变电子枪电场分布的作用。电子枪是一个静电透镜，阴极发射的电子束在静电场作用下，会聚在阳极孔附近，形成一直径约30μm的交叉点，这是电镜中的虚光源。聚光镜一般由两个电磁透镜组成，将来自电子枪的电子束会聚在标本上，并根据标本照明需要，控制照明电子束斑的大小、电流密度及孔径角。此外，为提高照明质量和控制照明孔径角，还设有聚光镜光阑和消像散器。在电子枪正下方还有电子倾斜和平移线圈，使照明电子束与聚光镜、成像透镜合轴。
成像装置 由样品室、物镜、中间镜及投影镜等组成。标本被电子束照射后，电子束穿过标本，经物镜形成一级放大像，再经中间镜及投影镜作二级及三级放大，成像于观察荧光屏或感光胶片上。图像最终放大率等于物镜、中间镜及投影镜放大率的乘积(图2)。

图 2 透射电镜成像装置的光线图

成像透镜是一种呈旋转对称的电磁场，对电子来说，电磁场显示出透镜的作用，所以称为“电磁透镜”或“电子透镜”，是电镜的基本部件。电磁透镜是一短螺旋管，通电时可产生非均匀的轴对称磁场，为增强磁场强度，往往还加有极靴，以缩短焦距，提高透镜放大系数。电磁透镜具有会聚、放大作用，能使在离轴不同距离处进入透镜的平行射线会聚于一点，得到一个清晰的像。若物体和像离开透镜中心的距离分别为物距u和像距v，它们与透镜焦距f的关系为1/u+1/v=1/f,1/f称为透镜的光学本领。用经验公式表示1/f=k^(NI)2/v ，常数k与透镜的几何形状及结构有关，Ⅰ是通过透镜线圈的励磁电流，N为线圈的匝数，v为加速电压。在K、N及v固定时，只要调节透镜电流就可以很方便地进行聚焦或改变透镜放大倍数。成像系统还设置物镜消像散器和物镜光阑，它们的作用分别是消除像散和增加图像反差。
样品室有侧插式和顶落式，位于聚光镜下方，紧靠物镜，包括有样品移动定位及气锁装置等。样品移动定位装置比较精密，通过连动机构，在真空外可以操纵样品台在x、y方向上作±1mm的移动，以寻找观察部位，并且要求样品台非常稳，不能有任何漂移。有的电镜样品台可作倾斜和旋转运动，可以安装加热、冷却、拉伸等附件。气锁装置是为了在不破坏镜筒高真空情况下，加入或更换样品，使仪器迅速恢复工作。
观察记录装置 位于镜筒的底部，包括观察室和照相室。观察室周围有1～3个铅玻璃的观察窗，室内有荧光屏，最终放大像形成于荧光屏上。观察室窗上还装有一立体显微镜，以便进行精确的调焦。由于电镜的焦深很长，一旦荧光屏上聚焦清楚，在荧光屏下方或上方的感光底片上也能得到清晰的图像。照相机一般位于荧光屏下方，设有自动曝光和自动换片装置，并可将底片序号和放大倍数随图像一起记录在底片上。
真空系统 电子束通道必须维持在高真空状态，以避免电子与空气中分子碰撞，产生电离、放电现象及改变成像电子的轨迹，同时可保护灯丝免受腐蚀以及减少标本的污染。真空系统由前级旋转泵、扩散泵或离子泵、真空管道、阀门及检测装置组成。由前级旋转泵进行粗抽，并在扩散泵出口处保持一个所需的低压强，再由扩散泵抽成高真空。现代电镜都采用自动真空系统，阀门由程序控制，自动启闭。真空检测大多采用布拉尼真空计或潘宁真空计，真空度由电流表指示。
电源系统 有高压电源、透镜电源及辅助电源。高压电源产生50～100kV的高压，用以加速电子，透镜电源为低压大电流电源，使电子束聚焦成像。高压电源和透镜电源需要相当高的稳定度，故一般都采用二三级电子稳流稳压线路。对辅助用电源则要求较低。
样品的制备技术 目前透射电镜分辨率已达0.1～0.2nm，但对生物样品的观察一般还只能达到几十毫微米的水平。这是因为一般透射电镜的电子束穿透能力有限(0.1μm以下); 生物样品多为轻元素组成，它们之间对电子散射能力差别小，故生物样品的固有反差小，限制了分辨率的提高； 生物样品含水多，在电镜高真空下会发生失水变形，所以生物样品的制备技术是获得高分辨率电镜图像的关键。根据生物样品的种类和不同的观察目的，相应采用超薄切片技术、负染色技术、金属投影技术、冷冻超薄切片技术、冰冻断裂蚀刻复型技术、电镜放射自显影技术、电镜细胞化学技术和生物大分子标本制备等制样方法。
超薄切片技术 是生物样品制备的基本技术，一般程序为： 取样→前固定→清洗→后固定→清洗→脱水→浸渍→包埋→聚合→超薄切片→切片染色→镜检。取样应在低温下动作迅速正确、材料体积小，避免机械损伤。固定通常采用前后二次化学固定，以固定细胞内不同的化学成分，前固定常用2.5%戊二醛在4℃下固定数小时，也有用甲醛、多聚甲醛作前固定。后固定常用1～2%锇酸（四氧化锇）在常温下固定1～2小时。固定前后必须用缓冲液浸洗，以避免各种化学试剂相互作用产生沉淀。脱水常用乙醇或丙酮，为避免细胞骤然失水变形，应采用浓度逐渐提高的梯度脱水方法。用脱水剂和包埋剂相混的溶液浸渍，以使包埋剂逐步取代脱水剂。包埋剂的种类很多，最常用的是环氧树脂(如环氧树脂618、Epon812)及低温包埋剂。包埋剂充填细胞内外间隙经聚合后具有一定的硬度和良好的机械切割特性。聚合常在60℃下经24小时，低温包埋剂需在-30℃以下经紫外光线照射而聚合。聚合后必须在专用的超薄切片机上用钻石刀或玻璃刀进行切片。切片厚度约为50～60nm，漂浮水槽中，即可捞到敷有支持膜的直径为3mm的载网上，晾干后进行电子染色，以增加反差。染色通常为双染色，即分别用醋酸铀和柠檬酸铅在常温下染色20～30分钟，清洗晾干后镜检。
负染色技术 也叫阴性反差染色，是通过染色剂来增加标本外周的密度，提高背景对电子散射的能力。生物标本结构本身相对通过较多的电子，从而使标本显示出负的反差，荧光屏上得到负的图像。常用的负染色剂有磷钨酸盐、醋酸铀等。操作方法有悬滴法和喷雾法。主要用来观察病毒、细菌、细胞器以及生物大分子等。其优点是标本反差和分辨率高，方法简便。
金属投影技术 利用金、铂等重金属在高真空中达到熔化状态，蒸发的金属粒子以一定的角度投射到样品上，产生投影的效果，反映出样品的表面形貌，主要用来观察病毒、细菌，尤其是核酸等生物大分子，若结合负染色效果更好。金属投影需要在高真空镀膜仪中进行，根据样品颗粒大小，采用不同的投影角度，一般需在25度以下，核酸分子投影角小于10度。若用旋转投影则效果更好。
冷冻超薄切片技术 即低温超薄切片技术，是近代发展起来的新技术，能克服化学固定时带来的对生物大分子结构和活性的损伤，代之以低温物理固定，使生物组织细胞在很高的降温速率下，内部水分迅速冻结成玻璃状，既能保持超微结构，又能保持生物大分子的活性。用冷冻超薄切片机切片后，可按常规处理观察，若用附有冷冻样品台的透射电镜观察，更能反映生物活体的真实情况。
冷冻断裂蚀刻复型技术 生物样品经低温固定后，进行劈裂曝露观察面，在高真空下适当升温，使观察面细胞内外间隙的冰适当升华，称为蚀刻。蚀刻后向表面喷镀铂碳混合物，以45度角投影形成复型，然后将样品腐蚀掉，漂浮复型，经清洗后捞于载网上即可镜检。该方法能够获得生物超微结构特别是生物膜的三维结构象，是研究生物膜结构的有效手段。
电镜细胞化学技术 主要对蛋白质 （尤其是酶）、核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子等细胞内化学物质的定性和定位研究。原理是利用化学试剂与细胞内某种物质起特异的化学反应，产生不溶性的电子致密沉淀物，在电镜下根据沉淀物来判断被检物的存在和分布。
免疫电镜技术实际上是电镜细胞化学的一种方法，它是把免疫化学和电镜技术相结合，在超微结构水平上研究抗体和抗原相结合的一种方法。其基本原理是利用被标记的抗体或抗原与被检抗原或抗体特异性结合，在电镜下根据标记物来判断被检抗原或抗体的存在和分布。标记方法有铁蛋白标记法、酶标记法、免疫酶搭挤法、杂种抗体标记法和胶体金标记法等。免疫电镜技术，可以对细胞表面或细胞内部的抗原进行定位，了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布、抗原-抗体复合物结构的细节，以及鉴定免疫损伤引起的细胞病理变化等。
电镜放射自显影技术 利用³H、¹⁴C等放射性同位素作为标记物，对细胞化学物质进行定位、定性和定量研究。其基本原理是将标记后的实验材料做成切片，再在切片上敷一单分子层乳胶膜，切片内放射性同位素衰变发生的射线使乳胶感光，经显影、定影被还原成银颗粒，可在电镜下检出，然后根据其分布情况，进一步判断细胞在代谢过程中生化物质的合成、分解、转运、分泌等动态变化。
生物大分子制样技术 是研究蛋白质和核酸分子形态和大小的方法。对蛋白质的研究大多用负染法，即将蛋白质溶液喷雾或悬滴在有支持膜(碳膜、微筛膜)的载网上，经染色后镜检。核酸样品制备用蛋白质单分子膜技术，方法有展开法、扩散法、一步释放法。其原理是许多碱性球蛋白(如细胞色素C)可以在低盐溶液或蒸馏水表面形成不溶解的变性薄膜，并能扩展成单分子层而形成由伸展的肽链构成的蛋白质分子网。肽链上氨基酸碱性侧链基团带有正电，它包围着带负电的核酸分子，当蛋白质分子在溶液表面展开时，核酸分子同时被拉开伸展，使核酸的形态与结构保持一定的完整性。展膜后将核酸分子捞到有支持膜的载网上，经负染色、旋转投影即可镜检。