超离心技术

一些生物颗粒和大分子，在重力场中沉降速度很小。但在很高的转速下，可以使其在离心场中快速沉降。超离心技术就是在很高转速下，分离并研究生物颗粒和大分子物理性质的方法。在这一技术中，应用的基本设备，就是超速离心机。
超速离心机 为本世纪二十年代，瑞典人Svedberg所设计。一般将每分钟转速>30,000转的离心机称为超速离心机，目前最大转速每分钟能达80,000转，离心加速度可达600,000×g。根据其用途的不同，又可分为制备型超速离心机和分析型超速离心机两种。前者主要用来将沉降速度不同的颗粒分开，而达到制备生物样品的目的。该类离心机由转动系统、真空系统、温度控制系统、速度控制系统、安全保护系统等组成；后者除上述构造以外，还具有光学分析系统，通过此种光学分析系统，可以进一步测定沉降速度或浓度分布，达到对不同颗粒进行分析的目的。常用的光学系统有三种（见表），用此三种系统测定的蛋白质及核酸的浓度范围不完全相同。

分析超速离心机中蛋白质、核酸浓度的测定范围

被分析样品	光学系统
	Schlieren 光学系统	干涉 光学 系统	吸收光学系统
			紫外照相	光电扫描
蛋白质(mg/ml) 核酸(mg/ml)	1.0～10.0 1.0～10.0	0.5～5 0.5～5	0.1～1.0 0.01～0.1	0.05～1.0 0.01～0.1

表中Schlieren光学系统测定的是溶液中折射率梯度（或浓度梯度）随r（距离转动中心的距离）的变化。干涉光学系统通过计数干涉条纹的数目来测定溶液中浓度c随r的变化。紫外吸收照相或紫外光电扫描光学系统测量的是溶液对紫外光的吸收值（或透光值）对r的变化。
近年来除对离心机和转头的寿命、温度系统、机械和电子线路包括各种安全控制系统等改进外，还采用了激光光源，微处理机控制和计算机联用等新技术，使其安全性、可靠性和自动化程度都有提高。除设计了专用的特殊转头外，在临床上还发展了离心分析器及可用来分析血清脂蛋白的“空气离心机”。
超速离心机主要用来分离和纯化生物大分子(蛋白质、酶、核酸)、病毒、细胞及细胞器等； 分析和鉴定其纯度或浓度、其分子量或分子量分布、浮力密度； 研究大分子的形状及大分子之间或大分子和小分子的相互作用。
基本原理 在重力场中，在距转动中心r (cm)处的加速度a=ω2r，其中ω为角速度，ω=2πn,n为每秒转数。离心时的离心加速度通常都用地球重力加速度(g)的倍数表示，如离心机每分钟转速为RPM，则其加速度a为：
a=1.118×10-⁵×(RPM)²×r
沉降系数s系表示颗粒或大分子在单位力场下的移动速度，即s=(dr/dt)/ω²r。如牛血清白蛋白的沉降系数为4.6×10-13秒。由于其移动速度很小，故定义1×10-13秒为1个Svedberg单位(1s)，则上述白蛋白的沉降系数即为4.6s。若大分子的密度低于溶剂的密度（如脂蛋白）则称为漂浮系数，用sf表示。
一种物质的沉降系数除与该物质的大小、形状、密度有关外，还与其水化程度，所用溶剂的密度和粘度等有关，而且不同浓度的样品所测得的沉降系数也不同。为此，将在标准溶剂中(20℃，水)，于理想情况下（浓度为零） 的沉降系数称为该物质的沉降常数，用s0_20,ω表示，它是通常由几个不同浓度下测得的s02₀,ω值外推至零浓度而求得的。在不同条件下测得的sCT值校正到标准条件的公式为：

其中η剂t为实验温度 (t℃) 下溶剂的粘度，η20·ω和ρ20·ω为20℃水的粘度和密度，ρt为实验温度下溶剂的密度。s值不仅表现了生物颗粒或大分子的重要性质，而且在应用中有重要价值，如在差速离心中，可以从s值来选择纯化该物质的最适条件，根据s值的大小，还可得知该种生物颗粒大小和计算分子量。
超离心技术的基本方法和应用 最常见的有以下三个方面：
(1) 差速离心法： 混合物中如有沉降速度不同的颗粒存在，纯化其中的一种颗粒时，可先低速离心除去大的颗粒，再高速离心以除去小的颗粒。这种通过反复的高、低速离心纯化物质的离心方法叫做差速离心法。此时总的回收率为Pⁿ (1-Pⁿ)，其中P为高速离心时沉淀中保留该物质的百分数，P′为低速离心时沉淀中保留的百分数，n为离心的次数。当两个颗粒的沉降系数差一个数量级以上时，用这种方法，能取得好的分离效果。图1所示为制备细胞中各组分的离心条件。
(2) 沉降速度法和沉降平衡法： 当颗粒在离心场中移动时，按公式动时，按公式 式中R为气体常数，T为绝对温度，ρ0为溶剂密度。这样就可以通过测定出的沉降系数s0，扩散常数D0和颗粒的比容V来计算该物质的分子量M，这种方法称为s/D法，也称沉降速度法。此外，也可根据经验公式直接由s求得M。如对于一些长链多聚物（例如核酸）可用公式s=KMa计算，其中K、α为常数。
当物质在离心场中长时间离心后，其沉降速度与扩散速度达到平衡，即池中各点没有物质的净转移。此时可以通过该物质浓度的分布来计算其分子量，此种方法称

图1 制备细胞各组分离心条件

为沉降平衡法。分子量计算如下式所示：

C₁、C₂为在距离轴心r₁、r₂处溶质的浓度。用本法常需较长时间的离心才能达到平衡。
(3) 密度梯度离心法： 在密度梯度离心中，溶剂（或称介质）的密度随离心半径的增加而增加 （即形成密度梯度），故称密度梯度离心。离心结束后，密度不同的大小颗粒或大分子分布在不同的区带上，所以此法也叫区带或带形离心法。这种方法的分辨力好，可比差速离心法提高1～2个数量级。它处理的样品量大，且不象差速离心法那样形成沉淀，因为有了梯度使样品得以稳定并能减小对流和扰动的影响，

(A)　(B)　(C)

图2 三种大小不同的颗粒速度区带离心示意图
(A)离心开始时将三种沉降速度不同的颗粒的混合物加在梯度液的顶部 (B)离心 (C)离心后按照它们沉降速度的不同分成三个分开的带

因此密度梯度离心法已成为分离大分子、细胞器以至细胞的重要方法之一。由于它的引入，可使制备离心成为分析定量的方法。
在密度梯度离心中可根据颗粒的大小或密度 （浮力密度） 的不同达到分离的目的。此种主要根据颗粒大小（沉降速度）不同达到分离目的的叫做速度梯度离心法(图2)。因为在梯度溶液中，随着离心半径的增加，梯度溶液的密度和粘度都有变化，所以，可用下式计算沉降系数：如果所用的梯度为等动力梯度，即大分子在其中作恒速运动，则在离心时，同时加入一个或多个性质相似的已知沉降系数 （或分子量）的大分子，即可由已知与未知大分子沉降距离的比算出未知大分子的沉降系数 （或分子量）。也可在线性蔗糖梯度上根据ω²t、梯度形状、大分子的密度和沉降的距离由计算机或通过一组表而计算出该大分子的沉降系数。
主要根据颗粒在介质中浮力密度不同而使之相互分离的称为等密度梯度离心(图3)。在密度梯度中达到

(A)　(B)　(C)

图3 二种浮力密度不同颗粒的等密度离心示意图
(A)开始时浮力密度不同的两种颗粒均匀分布于溶液中 (B)离心时，溶液中的盐形成梯度，颗粒移向与其浮力密度相等的位置 (C)离心后颗粒分别达到自己的等密度

平衡后，大分子在其等密度区形成带，(1-ρ0=0)。由此处梯度溶液的密度值可知此大分子在此梯度介质中的浮力密度。而且只要大分子是均一的，还可根据其带宽来计算分子量。