精液（斑）检验

法医学鉴定中、涉及强奸或猥亵行为、离婚、亲子鉴定以及死因不明而疑有性犯罪致死的女性尸体等，均需要作精液（斑）检验。
肉眼检查 精斑多附着于衣裤、被褥、手巾或地板上，有特殊气味，因附着物不同形态也不同。暗色布上精斑浓厚时，呈灰白色，似浆糊斑痕；精斑稀薄时，难以察见。在白色布质上，精斑呈黄白色地图状，边缘较中央明显，以手触之有硬感。用扩大镜检查，可在表面或布纤维中见黄白色鳞状小片。检查时必须记录其位置、形状、大小、数目等。
预试验 其中除酸性磷酸酶检验外，各项试验的灵敏度不高，且都不是精液所特有的。故一般可剪取肉眼可疑斑痕直接进行确证试验。预试验的方法有：
紫外线检查 在紫外线下，精斑呈明显的银白色荧光，周围较深，带紫蓝色边缘。经水洗或在有色布上的细小精斑，以肉眼不能识别者，在紫外线下仍可见荧光。紫外线下出现银白色荧光，并非精斑所特有。其他体液及分泌液斑，如阴道分泌物（白带）、唾液、乳汁、鼻涕、痰液、脓汁、尿液、残留有肥皂痕迹的衣物、浆糊斑、某些药物（如奎宁）、以及不少布质（如漂白布）或化学纤维制品因染有荧光物质，在紫外线下均呈类似的荧光，不易区别。故紫外线检查仅能作指向性试验，其阳性部位，用蜡笔画出范围，备作进一步检验。
碘化碘钾结晶试验(Florence试验) 精斑中卵磷脂逐渐析出胆碱，胆碱遇碘则形成过碘胆碱结晶。检验时剪取可疑斑痕少许，置于玻片上，加试剂(碘化钾1.65g、碘2.54g、加水30ml)1～2滴加盖玻片镜检。若含精斑，初见褐色颗粒，逐渐形成褐色或褐红色针状或菱形结晶。结晶不稳定，于生成后1～3小时可消失。
此结晶并非精斑特有。凡含有胆碱的物质如阴道粘液、子宫分泌液、脓液、鼻涕、唾液及肝、肾、肾上腺浸液以及某些压碎的昆虫或植物等，均可形成同样的结晶。
此试验灵敏度不高，用水稀释精液至1/400以上即呈阴性 (但若用酒精稀释则1/3000仍出现阳性)。精斑混有大小便、血液、酸类或其他化学药品时，将妨碍结晶的生成。精液卵磷脂未分解成胆碱，或精斑稍陈旧(经1～2个月以上)，或细菌破坏胆碱，均可呈阴性结果。
在观察结晶时，有时在视野中偶而可发现从基质脱离的精子（染成棕黄色），则可肯定是精斑。
锌检查法 精斑含有高浓度的锌 (每克干燥精斑含锌量为1.998mg)，在人体组织中含锌量最高，故可利用检测锌证明精斑。
取精斑浸出液0.5ml，按顺序加入5%醋酸钠2ml、50%硫代硫酸钠0.4ml、双硫腙四氯化碳1.5ml，混合，振摇1分钟。若为精斑即出现猩红色或粉红色。其他体液，如阴道分泌液、尿道分泌物、尿、粪、痰、唾液、胃液、羊水、泪液、脓汁及腹水等均呈阴性反应。乳汁含锌量也相当高，故也呈阳性反应，但适当稀释即呈阴性。
酸性磷酸酶检验 精液的主要成分为前列腺分泌液，含有大量酸性磷酸酶，每毫升达540～4000单位 (纯前列腺液更高，达3300～23,200单位)，而其他体液分泌液含量较少：阴道液2单位，尿1.2单位，血清0.1单位，全血2.9单位，尿道分泌物2.3单位，胃液0.1单位，唾液0.05单位。据Simpson(1974)报告，人精液含酸性磷酸酶2,500单位/ml以上，猴与人相似，而其他动物精液少于12单位/ml，鼠的包皮腺液含27～104单位，表面酵母(top yeast)在水中似精液，但只含约130单位/ml。许多植物也含少量，如山毛榉(beech)叶含48单位。
性交后15～35小时仍可在阴道内检出精液中的酸性磷酸酶，输精管结扎者也呈阳性（因有前列腺液）。纤维上的精斑最适宜于作检验，只有纤维被砷酸钠或醋酸苯汞污染时才受干扰。检材暴露于室温可使酸性磷酸酶浓度逐渐下降。加热至60℃，则5分钟内即被破坏，在冰箱中可长期保存。
酸性磷酸酶检验法有多种，一般应用定性法。精液中的酸性磷酸酶，可分解磷酸苯二钠，产生萘酚，萘酚经铁氰化钾的作用，与氨基安替比林结合，产生红色醌类化合物。
检验时剪取检材少许(约0.1×0.1cm，最好取斑痕周围部分，因该处酸性磷酸酶活性最高)，置试管内，加缓冲液(枸橼酸14g,1N氢氧化钠12.5ml，磷酸苯二酚0.2g,4-氨基安替比林0.6g，蒸馏水加至100ml) 3～4滴，经37℃5～7分钟后，再加显色液(1N氢氧化钠16.7ml，碳酸氢钠1.4g，铁氰化钾3.6g，水加至100ml) 3～4滴。同时剪取无斑痕处及已知精斑作对照检验。
若斑痕附于有色基质上，为避免颜色干扰，可用盐水沾湿的滤纸，擦拭斑痕数次，再将滤纸放入试管，按上述操作。
若检材为精斑，因含酸性磷酸酶，立即出现浅红色至深红色反应，颜色深浅因精斑浓度而异，若浓度过高，可出现红色沉淀。阴性反应为橙黄色。精液稀释至1/20,000仍可呈阳性反应，但孵置时间要适当延长。经11年的陈旧精斑也呈阳性反应。在强奸案件中，精液常混有血液，但不影响本检验法，血痕在试验中呈灰褐色，而精液呈红色。内脏(肺、肝、肾、心、胃)块浸液(1g:5ml缓冲液)及成人男子尿液也出现明显红色。但此两者稀释100倍则呈阴性。鼻涕、唾液、汗液呈弱阳性反应。故检验时应注意这些物质干扰所出现的假阳性反应。但若将检材浸液与已知酸性磷酸酶作比色测定(用光电比色计520nm滤色板)，则可测定酸性磷酸酶的含量。酸性磷酸酶浓度大于300单位/ml可推测是精斑，如大于500单位殆无其他斑痕的可能性，但本法仍不能取代检出精子。
也可用聚丙烯酰胺凝胶电泳法区别精液与阴道分泌液的酸性磷酸酶，因两者的电泳移动度不同（精液较快），这对于鉴别无精子或少精子的精液较有价值(但也有例外，有些阴道液的酸性磷酸酶泳动也可较快)。用电泳法还可区别精液酸性磷酸酶与大便的和阴道酵母菌的酸性磷酸酶。
薄层色谱法 将精斑用1N盐酸溶解，点样于硅胶-G薄层板，层析后，分别染出胆碱及精素，可测出0.01ml精液，无精子精液也呈阳性，而精液以外的各种体液和排泄液均阴性。经过5年的精斑、腐败的精液或加热100℃、90分钟的精液仍呈阳性，并不受果汁等干扰。
确证试验 确定为精液斑的方法有多种，最可靠者系检出精子和用抗人精液血清沉淀反应。后者对无精子精液或输精管结扎后的精液更具实用价值。
精子检出法 人的精子为蝌蚪状，全长50～70μm，头部平面呈椭圆形，侧面呈梨形，长4.5～5.2μm，宽2.9～3.6μm；中间部（包括颈部及结合部）呈圆柱状，长6μm；尾部细长，长40～60μm。精斑中的精子不易破坏。干燥精斑中精子有时可保存十多年，较牢固地附着在纤维基质上，不易分离，检出较难。陈旧斑痕，常仅能分离出精子的头部，易与植物细胞、阴道滴虫、酵母菌等相混淆，应仔细鉴别。
剪取斑痕中央部分约1cm2，置试管内，滴加盐水约0.3ml，浸湿后用组织针小心分离纤维，室温2小时，冰箱12～24小时后用玻棒压挤检材，再用毛细吸管吸吹几次后，吸出全部浸液，放入试管内，离心(2500rpm)5分钟，上清液备作抗人精液血清沉淀反应（见后），沉渣作涂片。陈旧精斑，盐水浸渍不易分离精子，需加5～10%氨液(甚至在40%氨液)中浸渍，离心沉淀，弃去上清液，加生理盐水适量，洗涤沉淀物。再离心，取沉淀作涂片、染色，镜检。本法检查精子阳性率高，但上清液不能做血清沉淀反应。亦可用0.8%盐酸或醋酸、胰酶、冰醋酸及浓硫酸等浸渍。
精子染色常用苏木素伊红染色法。涂片经甲醇固定1分钟后，用苏木素染色2～5分钟，伊红2～5分钟。也可用Baecchi染色法。涂片经甲醇固定后，用染色液(1%亚蓝1ml、1%酸性品红1ml及1%盐酸40ml)染色5分钟。也可用Corin-Stockis法酸性品红靛蓝胭脂红或伊红靛蓝胭脂红等染色法。或将染色液(如藻红、甲基蓝等)滴入含沉渣的离心管内染色，离心后、沉渣涂片镜检。
若用苏木素伊红染色，精子头部的后半部（即核）染成蓝色，前半部不着色或浅染，精子中间部及尾部染红色。Baecchi染色法，精子头部红色，中间部及尾部蓝色，极为特殊。若找到一个精子，即能确证为精斑。但陈旧精斑，或浸渍处理过分粗暴，常只检见精子头部，此时，若有几个典型的精子头部也可确定是精斑。镜下还可检见少许上皮细胞、白细胞、脂肪球、色素颗粒等，若混有阴道液（从阴道流出的精液或阴道涂抹标本）则可见大量阴道上皮细胞。也可用扫描电子显微镜检查精子，检材用缓冲液浸渍后，不需染色，即可检出精子。
抗人精液血清沉淀反应 用人精液注射家兔，制备抗人精液免疫血清，用此抗血清与检材浸出液作沉淀反应，阳性即表明检材含有人的精斑。
此试验灵敏度高，并具种属特异性，检出率远比精子检出法为高，对无精子的精液斑更具有价值。故检验精斑可先用紫外线检查确定范围，将可疑斑痕用盐水浸出，离心，上清液作血清沉淀反应，沉渣染色后寻找精子，两者均呈阳性便可肯定系人精斑。但陈旧精斑有时只得沉淀反应阳性，如该抗人精液免疫血清有高度特异性，也可下肯定结论。关键在于能否制备高效价的特异性抗人精液血清。如系较新鲜的精斑，而沉淀反应强阳性，但无精子检见，则对可疑者（精液中无精子或输精管已经结扎）增加一强有力的个人认定（或否定）的依据。
抗人精液免疫血清的制备： 基本上同抗人血红蛋白免疫血清。一般以10%人精液注射家兔眼结合膜下，经末次免疫，抗体效价达2,000以上，即可采血。若有非特异性反应（对人血清），可加1/10人血清进行吸收，以除去非特异性沉淀素(即对1/100人血清、阴道液、唾液等不起反应)，是为特异性抗人精液沉淀素血清。
试验操作： 剪取检材作盐水浸液。取浸液与抗人精液沉淀素血清作环状沉淀反应，60分钟内出现沉淀环为阳性反应。本试验亦应有无斑痕部位检材、已知人精液、阴道液及血痕等作对照。
特异性抗人精液沉淀素血清，对陈旧精斑的阳性检出率较精子检出法为高，而且对阴道分泌液未见非特异性反应（表）。

精斑确证试验两种方法比较

检 材	例数	抗精沉淀试 验阳性例数	精子检出法（例数）
			见完整精子	见精子头	合计
14年精斑	10	9	2	6	8
10年精斑	14	14	4	8	12
结扎输精管后 8年的精斑	2	2	0	0	0
8年的阴道液 斑（对照）	2	0	0	0	0

注： 抗人精液血清效价为2000
精斑的沉淀反应也可在琼脂胶质中进行 （琼脂扩散试验）。在中央孔滴加抗人精液血清，周围孔滴加检材浸液，然后观察中央孔与周围孔之间有无沉淀带出现。最后用氨基黑10B等染色，可作证据保存。
电泳测定乳酸脱氢酶(LDH-X) 木户启(1978)，用淀粉凝胶电泳测定精液、肝、心的乳酸脱氢酶的同功酶，均见LDH-1,LDH-2,LDH-3,LDH-4,LDH-5，而精液及成人睾丸在LDH-3与LDH-4之间尚有LDH-X，少精子者LDH-X很弱，无精子者则无LDH-X。精斑在夏天经四周或稀释8～16倍仍可证明LDH-X，而阴道液斑则无LDH-X，性交后阴道内容物有27/34例可证明LDH-X。用于性犯罪案件，LDH-X见于10/15例酸性磷酸酶阳性者。有两例镜检精子阴性而LDH-X却阳性者，故认为本法有时比精子检出法更为可靠。
精斑血型鉴定 精液是一种分泌液，故分泌型人的精液可检出A,B,H,Lewis等血型物质。其中A,B,H物质含量稍高于唾液，更远比红细胞为高。一般活体阴道内精液经2日仍可证明血型。
吸收试验 精斑中含有大量血型物质，能与相应的凝集素相结合，故将精斑与已知效价的抗A，抗B血清作用后，再测定其效价减少情况，便可判定精斑的血型。
此试验也必须用已知分泌型精斑（或唾液斑）作对照，若对照成立，而无精斑处的凝集与精斑相差3级以上，便可判定含有相应的血型抗原。
中和试验 精斑（和其他体液斑）中的血型物质是水溶性，耐热，故可用盐水先将精斑中血型物质溶出，然后将浸液置于煮沸水浴里10分钟，离心，以去除杂质(如蛋白，细菌及检材基质等)的干扰。将上清液与已知抗A，抗B血清混合，若精液含有血型物质，便可与相应凝集素相结合（中和），比较中和前后的凝集素效价，便能判断精液中的血型物质。用中和法测定精斑血型，准确性较吸收法为高。
解离试验 精斑及其他分泌液的血型物质，因易溶于水，故用血痕的解离试验不易成功。但若先将精斑用1%鸡蛋白、10%福马林或10%戊二醛固定后，则可作解离试验检出微量精斑的血型。其步骤和结果判断同血痕的解离试验。
混合凝集反应 与解离试验同样，先将精斑检材用1%鸡蛋白、10%福马林或戊二醛固定后 （或不固定而作精子浸出液），再以血痕混合凝集反应相同方法，进行检验。
上述试验法任何一种，若呈阳性结果，表示精斑中有A或/及B血型物质，若呈阴性结果，则可能是O型或非分泌型精斑，或检材中血型抗原已被完全破坏，此时就必须用抗H抗体，证实是否O型精斑。解离试验及混合凝集反应灵敏度极高，对所谓的非分泌型精斑，也可检出A、B、H血型物质。但如放置已久或已腐败的精斑，血型物质已经破坏，有误认为非分泌型的可能，此时也可用抗Lea血清进行试验，“非分泌型者”应系阳性。除红细胞血型外，精斑也可测出血清型Gm,Km，酶型AK,PGM,GLO、6PGD及酞型等。精液中酸性磷酸酶也可用电泳法分离及定型，据报道可分S、F、O三型。