病毒灭活

病毒灭活是指理化因子直接作用于病毒，使病毒失去活性。
1. 物理因子：
(1)温度： 提高温度对病毒有灭活作用。这是因为温度高于70℃时可使病毒蛋白质变性，也可使双链DNA解开成单链或使核糖-磷酸键断裂，从而影响以下一种或一种以上的后果：
❶病毒颗粒失去吸附于细胞受体的能力；
❷使病毒（有内在酶的病毒）颗粒中的酶失去活性；
❸阻碍病毒脱壳而使核酸不能释放出来；
❹使核酸完全不能或部分不能复制、转录、转译。对大多数病毒来说，对不同温度的半数致死期：在60℃条件下以秒计； 在30℃，以分计；在20℃，以小时计；在4℃，以天计；在-70℃，以月计。然而，不同病毒对热的耐受性很不相同，有包膜的病毒如粘病毒等很不耐热。乙型肝炎病毒很耐热，在60～80℃可耐受30分钟之久。同一种病毒不同株对热稳定性也可不同，如乙型脑炎病毒北京株对热稳定性比中山株为强。低温一般不易使病毒灭活，所以常用低温法保存病毒。有的病毒（如呼吸道合胞病毒）很易受冰冻-融化的影响而使病毒失活。
(2)辐射：分电离辐射(如X射线、γ射线)和非电离辐射（如紫外线）两种，二者使病毒灭活的机理不相同。电离辐射能使物质（病毒）发生电离，这种电离是射线撞击物质里束缚电子的结果。电离辐射能作用于病毒颗粒的各部分，很少选择性。而紫外线作用于病毒时，有一定的选择性，因病毒核酸的嘌呤、嘧啶环以及蛋白质（与芳香族氨基酸含量有关）能吸收紫外线。电离辐射的直接作用可破坏病毒蛋白及其核酸的共价键，使病毒灭活。电离辐射也可间接使病毒灭活，因电离辐射作用于水溶液后能产生氢离子、氢氧离子和过氧化物，这些物质也可使病毒灭活。电离辐射的能量比非电离辐射的能量大得多。电离辐射灭活单链核酸病毒的能力比灭活双链核酸病毒的能力约大10倍，因单链核酸易被切断。对双链的核酸，在两条链的邻近处被切断时，才能使双链螺旋结构破坏。紫外线作用于病毒核酸时，一般没有核苷酸链的断裂(但大于10⁴erg/mm²的能量也可使链断裂)。中等剂量的紫外线作用于病毒核酸，可产生以下一种或一种以上的变化：
❶DNA链上邻近胸腺嘧啶之间或RNA链上邻近尿嘧啶之间共价结合，而相应地产生胸腺嘧啶二聚体和尿嘧啶二聚体(图1);
❷在嘧啶的C₅～C₆双键上由水合作用而形成5-氢-6-羟衍生物(图2);
❸双链核酸互补链上的嘧啶形成交联。由于以上这些变化可使病毒灭活，也可使病毒突变率增加。

图1 DNA上邻近胸腺嘧啶形成胸腺嘧啶二聚体

图2 尿嘧啶的C₅～C₆双键上由水合作用形成5-氢-5-羟衍生物

由紫外线形成的嘧啶二聚体，可由两种机理复原：
❶光复活作用，在350～450nm可见光的作用下，在宿主细胞中活化了一种切开嘧啶二聚体的酶，从而使碱基恢复至原来的形式；
❷暗复活作用，在修复过程中有一系列的酶参与作用，由内切酶、外切酶相应地把二聚体和与二聚体邻近的核苷酸切去，然后，在DNA多聚酶和连结酶的作用下，修复被切去的核苷酸，使核苷酸链复原。
(3) 声波：很早就发现声波能使TMV、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒等灭活。其灭活病毒的机理是： 声波直接作用于病毒，使病毒裂解；声波处理病毒悬液时可形成许多小气泡，气泡随即破裂，在气泡形成及迅速破裂时，可发生剧烈的压力变化，致使病毒裂解。声波处理受病毒感染的细胞，可使病毒易于从细胞中释放出来，从而提高病毒的收获量。常用于提高血凝素、补体结合抗原的滴度。用酚提取病毒核酸时，辅以低频率声波的作用，使病毒核酸更易释放出来以提高病毒核酸的提取量。
(4) 干燥： 一般对病毒的活力影响很小。病毒悬液经冰冻后，用快速真空干燥法除去水分及空气，经密封后，病毒活力往往可保持数年、数十年之久。所以，常用此方法保存病毒种。研究病毒在室温条件下对干燥的抵抗力，在流行病学上是有意义的，如流感病毒污染物，在室温条件下对干燥的抵抗力很差，说明它在尘埃中不能维持多久；而天花的痂皮或其他污染物在干燥和室温中，病毒活力能维持较久，故污染有天花病毒的尘埃易于传播天花。
2. 化学因子：
(1) 甲醛： 可灭活病毒。甲醛作用于病毒核酸是使病毒灭活的主要原因。甲醛作用于病毒蛋白，可能仅阻碍核酸从病毒颗粒中释放出来，而使病毒失去感染力。低浓度甲醛灭活病毒后，仍保持其抗原性，所以，广泛应用于制备疫苗。甲醛与病毒蛋白作用时，首先很快地与一级氨基作用，而形成羟甲基或二羟甲基衍生物，然后羟甲基基团与酰胺或胍基团[(CH₂N)₂C:NH]形成亚甲桥(me-thylene bridges)化合物，即形成交联，其反应如下：

甲醛与蛋白质作用初期仅形成羟甲基化合物，这个反应是可逆反应，当形成交联后，则为不可逆反应。甲醛作用于病毒核酸的部位，根据TMV-RNA与醛反应的研究，说明甲醛仅与含有氨基的核苷酸碱基反应(即腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶)。
(2)β-丙烯内酯： 其结构式为容易开环，所以性质很活泼，可与氨基、吲哚和吡咯等起反应。在不同pH条件下，β-丙烯内酯与不同氨基酸的反应能力是不同的。在pH中性时，β-丙烯内酯变为丙酸而与氨基作用。β-丙烯内酯也可与核酸起反应，特别易于与鸟苷酸、脱氧鸟苷酸起反应，其反应产物经水解后能获得7-(2-羧基乙基)鸟嘌呤。β-丙烯内酯对病毒灭活能力虽然很强，但对其抗原性影响很小。β-丙烯内酯可用于消毒空气中的病毒。
(3)蛋白变性剂：酚、脲、苯甲酸、水杨酸、胍、十二烷基硫酸钠(SDS)等都可使蛋白质不同程度的变性。蛋白变性剂对病毒的灭活作用主要是影响病毒吸附于细胞的能力。在病毒学中，酚常用于分离病毒核酸；SDS常用于分离病毒的多肽，也用于分离病毒的核酸。
(4)有机溶剂：短链的醇在冷环境中并不灭活病毒，但能使病毒沉淀，因此，常用甲醇提纯病毒。丁醇等较长链的醇可使病毒悬液中非病毒蛋白沉淀，有人曾用此原理提纯脊髓灰质炎病毒。但必须注意，在温度较高的情况下，可使病毒失活。乙醚能使有包膜的粘病毒灭活，所以常用于初步鉴定病毒。