病毒培养和分离

病毒培养是指用人工的方法使病毒在体外生长、增殖，以达到扩增、滴定、鉴定病毒等目的。由于病毒具有严格的活细胞内寄生性，所以培养方法需要采用活组织细胞系统。病毒分离是指采用培养病毒的易感动物或组织培养系统，从受感染组织或病人的其他材料中分离病毒。
病毒培养分离的方法有动物培养法、鸡胎培养法和组织培养法。
用动物培养法培养分离病毒所选用的实验动物应该是对所需要分离的病毒高度易感的。动物培养所选用的动物种类和接种途径取决于病毒所致疾病的主要病变的部位以及动物实验的目的和要求。病变主要在神经系统的用脑内接种法，在呼吸道的用鼻腔接种法，在胃肠道的用经口灌注法，在皮肤的用皮内或皮下接种法，在内脏的用腹腔、静脉或肌肉内接种法(表1)。接种24小时以后观察动物是否出现病态或发生死亡，或检测其器官组织内是否有病毒抗原。取病变组织传代，进行病毒鉴定。接种动物分离病毒必须排除动物本身存在的病毒。
动物培养法主要应用于：
❶研究病毒的致病性、免疫性和发病机理；
❷某些病毒（例如披膜病毒）的实验诊断和血清流行病学调查；
❸制备病毒诊断抗原；
❹制备免疫血清；
❺肿瘤病毒的研究。
鸡胎培养法是应用鸡胎的绒毛尿囊膜或囊腔(即羊膜腔、尿囊腔和卵黄囊)以及其组织或器官来培养不同的动物病毒。将病毒接种鸡胎培养后，可以用直接法或间接法检查病毒增殖情况。直接法是观察绒毛尿囊膜上形成的痘疱、鸡胎的特殊损害、鸡胎生长迟缓和鸡胎死亡等现象。间接法是用血细胞凝集试验或补体结合试验等第二指标系统检测培养结果(表2)。

表1 病毒分离常用的实验动物和接种途径

病 毒	实验动物	接种途径
乙型脑炎病毒 森林脑炎病毒 马脑炎病毒(东部、西部 委内瑞拉)	小白鼠，恒河猴 小白鼠，恒河猴 小白鼠，金地鼠，豚鼠， 家兔	脑内 脑内 脑内
淋巴细胞性脉络丛脑膜 炎病毒	小白鼠，豚鼠	脑内
狂犬病病毒	小白鼠，金地鼠，豚鼠， 家兔	脑内
脊髓灰质炎病毒 柯萨奇病毒B组 单纯疱疹病毒	恒河猴，黑猩猩 新生小白鼠 小白鼠 家兔	脑内 脑内 脑内 角膜
流感病毒 呼吸道合胞病毒	雪貂 黑猩猩，狒狒，豚鼠，雪 貂，新生金地鼠	鼻腔 鼻腔
麻疹病毒 风疹病毒 天花病毒*	恒河猴 恒河猴 家兔 恒河猴	鼻腔 鼻腔 角膜 皮肤
水痘-带状疱疹病毒	家兔 恒河猴	睾丸 脑内
痘苗病毒 柯萨奇病毒A组 腮腺炎病毒 黄热病毒	家兔，恒河猴 新生小白鼠 恒河猴 小白鼠，豚鼠 恒河猴	角膜 肌内，腹腔 腮腺 腹腔 脑内
登革病毒	新生小白鼠 猴	脑内 眼结膜
甲型肝炎病毒 乙型肝炎病毒 流行性出血热病毒	狨猴，黑猩猩 黑猩猩 黑线姬鼠	胃肠道 静脉内 腹腔

*自1978年以来，无新病例发生。
鸡胎培养法主要应用于：
❶天花、痘苗和牛痘病毒的分离、鉴定和疫苗制备；
❷大多数流感病毒株的分离；
❸披膜病毒的分离；
❹流感、腮腺炎等病毒诊断抗原的制备。
用组织培养法培养分离病毒所选用的组织或细胞种类取决于所需要分离的病毒的种类，主要根据它对病毒的感受性和它的来源难易而定 (表3)。组织培养的主要类型有原代细胞培养、传代细胞培养、二倍体细胞培养、器官培养、悬浮培养、克隆细胞（纯系细胞）培养、混合细胞培养和融合细胞培养。常用的病毒增殖指标是观察细胞病变的方法。许多病毒在细胞内繁殖时，可以破坏细胞，受感染的单层细胞可以出现细胞损伤的组织学指征。这些改变称为致细胞病变作用，可以表明病毒增殖的情况。有的病毒能在细胞内增殖，但是不产生明显的病变，可以用血细胞吸附法、干扰法、免疫荧光法、免疫酶法、放射免疫法、生物化学法等检测病毒的增殖。很多病毒接种到细胞培养后可以形成蚀斑，可以用蚀斑作为感染的指标。在无生物学指标的情况下，应用电子显微镜法有时可以查见病毒颗粒，甚至缺损病毒的核壳。

表2 常见的病毒在鸡胎内的增殖

病 毒	鸡胎日龄	接种途径	培养温度(℃)	培育时间	收获材料	观察指标
流感病毒 腮腺炎病毒 单纯疱疹病毒 水痘病毒 痘苗病毒 乙型脑炎病毒 东部马脑炎病毒	9～12 5～7 10～13 10～13 10～12 6～8 10～12	尿囊、羊膜腔 尿囊、羊膜腔 绒毛尿囊膜 绒毛尿囊膜 绒毛尿囊膜 卵黄囊 羊膜腔	33～35 35 37 37 37 37 37	36～48小时 5～7天 2～6天 3～5天 2～3天 3天 18小时	尿囊液、羊水 尿囊液、羊水 绒毛尿囊膜 绒毛尿囊膜 绒毛尿囊膜 鸡胎、尿囊液 羊水、鸡胎	血凝 血液 痘疱 痘疱 痘疱 死亡 死亡

表3 病毒分离常用的组织培养

病 毒	组织培养
脊髓灰质炎病毒	恒河猴肾，人胎肾，人胎肺，人羊膜 HeLa, HEp-2
柯萨奇病毒A组9和16型 柯萨奇病毒B组 ECHO病毒	恒河猴肾 恒河猴肾 恒河猴肾，人胎肾，人胎肺，人羊膜， 人二倍体
呼肠孤病毒	恒河猴肾，人胎肾，人羊膜，豚鼠肾， 小牛肾，HeLa
鼻病毒 流感病毒 副流感病毒	恒河猴肾，人胎肾，人二倍体 恒河猴肾，人胎肾 恒河猴肾，人胎肾，人胎肺，新生豚 鼠肾
呼吸道合胞病毒 腺病毒	HEp-2,HeLa, Chang氏肝 人胎肾，人羊膜，人气管上皮，兔 肾，兔气管上皮，人胎气管器官， HeLa,KB,HEp-2
冠状病毒	人胎气管纤毛上皮器官，传代人胎 肾
麻疹病毒	人胎肾，人羊膜，人二倍体，恒河 猴肾
腮腺炎病毒 单纯疱疹病毒	恒河猴肾，HeLa 恒河猴肾，人胎肾，金地鼠肾，兔肾， 人羊膜，HeLa
天花病毒* 痘苗病毒	金地鼠肾，豚鼠肺 恒河猴肾，人胎肾，金地鼠肾，兔肾， 人成纤维，HeLa, HEp-2
乙型脑炎病毒	人胎肾，人二倍体，金地鼠肾

* 自1978年以来，已无新病例发生。
组织培养法主要应用于：
❶病毒的分离和鉴定；
❷病毒的滴定；
❸抗体的检测；
❹疫苗和抗原的制备；
❺病毒增殖机理的研究。
病毒分离后必须进行病毒鉴定。初步鉴定可以根据病人的临床表现、流行病学特点、病毒的动物感染范围和潜伏期、组织培养的条件、细胞病变或蚀斑、病毒包涵体、电子显微镜和免疫电子显微镜观察、超过滤、病毒的核酸类型、对乙醚的易感性、对化学抑制物的易感性、凝集血细胞的性能、吸附血细胞的性能、溶解红细胞的性能、干扰现象和代谢作用等作出判断。然后再将分离出的病毒株同病人的急性期和恢复期血清进行补体结合试验或血凝抑制试验测定抗体，同已知的标准抗血清作中和试验、补体结合试验或血凝抑制试验进行鉴定； 将分离的病毒株注射动物，制备高价免疫血清，同已知病毒株作中和试验；或用分离的病毒株和已知病毒株分别免疫动物，经一段时间后，用已知病毒株攻击，观察其保护效果。这样可以确定分离的病毒株的种型及其病原学关系。
从持续性感染的材料中分离病毒，特别是在潜伏状态的病毒的方法是取病变组织做体外细胞培养。可以采用培养法和共同培养法。培养法是用胰蛋白酶分散新鲜组织，使分散的细胞长成单层细胞，长期培养，观察病毒引起的细胞改变。共同培养法是将胰蛋白酶分散的细胞同对病毒易感的单层培养细胞共同培养，观察致细胞病变作用。从受感染组织分离有感染性的病毒时，使用活细胞比使用组织匀浆更为优越，特别是在中枢神经系统的慢病毒感染。虽然用免疫荧光法在亚急性硬化性全脑炎病人的脑细胞培养中检测出麻疹病毒抗原的存在，可是有感染性的麻疹病毒一直到将脑细胞同HeLa细胞系或绿猴肾细胞系(BSC1)共同培养时才被分离出来。当同原代绿猴肾细胞共同培养并融合时，从进行性多灶性白质脑病病人的脑细胞分离出同SV₄₀病毒有关的一种乳多泡病毒。另一种乳多泡病毒，JC病毒，也被从一例进行性多灶性白质脑病病人的脑匀浆中分离出来。这种培养法和共同培养法在最近的将来可能被广泛地用于从疑似病毒性病原的其他慢性疾病分离病毒。