核酸的固相合成

在一种不溶性的高分子载体上进行的核酸链的合成称为核酸的固相合成。核酸的固相合成是在液相合成的基础上，根据Merrifield建立的多肽固相合成的经验发展起来的。和多肽的固相合成类似，核酸固相合成的基本原理是将所要合成的寡核苷酸片段的末端核苷或核苷酸共价连接到一种不溶性的高聚物载体上。常用的固相载体有控制的多孔玻珠(CPG)、硅胶、交联的聚苯乙烯和纤维素等。然后由此开始，按照所要求的核苷酸顺序逐步地增长寡核苷酸链。每轮缩合可以接长一个核苷酸或一个二聚以上的短片段。反应后溶液中过量的原料、试剂或分解产物通过洗涤和过滤步骤除去，未反应完全的羟基则用试剂封闭。当寡核苷酸链延伸达到预期的长度后，将它从固相载体上切下，脱去全部保护基，再经分离纯化即可得到最终产物。

图1 用固相磷酸三酯法合成寡核苷酸

图2 用固相亚磷酸三酯法合成二核苷酸

图3 用亚磷酸三酯法合成寡核苷酸

酯法和固相亚磷酸三酯法两种。前者所依据的方法基础是液相磷酸三酯法，即挂在固相载体上的羟基组份每次只与一个碱基和5′羟基都保护了的核苷-3′-磷酸二酯反应，中间产物是磷酸三酯(图1)。后者的化学反应基础是亚磷酸三酯法 (图2)，其步骤是用保护核苷的3′-亚磷酰衍生物与挂在固相上的核苷或核苷酸链的5′羟基反应生成亚磷酸三酯型的中间物，然后再氧化得到磷酸三酯(图3)。
与固相磷酸三酯法相比，固相亚磷酸三酯法的突出优点是：
❶产率高，每轮连接的产率可达95～98%;
❷速度快，只需30分钟即可完成一轮缩合操作循环；
❸由于多轮缩合的产率很高，不仅可能合成较长的片段，产物也易于分离纯化，且能实现自动化和微量化。
随着核酸固相合成方法的建立和发展，近年来已经出现了各种型号的全自动或半自动的核酸合成仪。目前利用以固相亚磷酸三酯法为基础的最新型的 DNA 合成仪，其合成的长度已能达到60核苷酸左右，并正向100核苷酸进军。