核糖核酸一级结构的测定方法

核酸一级结构研究的发展历史说明，无论是RNA还是DNA的一级结构研究都离不开巧妙地使用各种工具酶。60年代RNA一级结构研究所以取得飞跃发展，重要条件之一是许多作用于RNA的工具酶的相继提纯和它们的专一性的阐明。
研究RNA一级结构的工具酶 工具酶的研究是核酸结构研究不可缺少的一个重要方面。用于RNA结构研究的一些重要工具酶见表1。
核糖核酸酶(RNase) 一类水解RNA的酶的统称，广泛存在于所有动植物和微生物之中。根据水解专一性，RNase可分为碱基特异性的RNase(如RNase A、RNaseT1和RNase U₂等) 和非特异性 RNase (如RNase T2和RNase Phy M等)。
1. RNase A:从牛胰中提取的一种RNase，专一性地水解RNA链中的嘧啶核苷酸键，产生3′嘧啶核苷酸和以3′端为嘧啶核苷酸的寡核苷酸。也水解许多碱基上被修饰的嘧啶核苷酸(表2)。RNase A的水解专一性不是绝对的，在高酶浓度时也水解聚腺苷酸，生成3′腺苷酸。
2. RNase T₁:从一种米麴（霉菌）中制得的具有高度碱基专一性的，能特异性地水解RNA产生3′鸟苷酸和3′端为鸟苷酸的寡核苷酸的一种RNase。该酶也能水解肌苷酸(Ip)和部分碱基上被修饰的鸟苷酸键，见表2。其中水解m22Gp键的速度极慢，且产物是m22G-2′,3′-环磷酸(m22G>p)。
3. RNase U₂:从一种黑粉菌(Ustilago sphaerogena)的培养液中提取的一种对嘌呤核苷酸键专一的RNase。其水解专一性正好与RNase A互补，但产物往往是2′,3′-环状的嘌呤核苷酸。与RNase T，相比较其水解专一性不是绝对的，水解二核苷一磷酸的速度依次是A-N>G-N⨠C-N>U-N。 在结构分析中使用该酶时常先将RNA分子上的鸟嘌呤碱基用化学试剂特异性地修饰 （例如水溶性碳二亚胺等），修饰后的鸟苷酸键不受RNase U₂水解，这样RNase U2只能作用于RNA链上的腺苷酸键了。除A和G外该酶还能水解I和V，但不能水解X、i6A、ms2i6A、t6A、m7G和m22G等修饰核苷酸键。
4. RNase T₂:也是从米麴中制得的一种非特异性RN-ase。它水解RNA的最适pH为4.5，水解各种2′-,3′-环状核苷酸的最适pH为6.0～6.3。该酶能水解所有的修饰核苷酸键，包括RNase T1和RNase U2 不能水解的m7G键等。但它不能水解CMC-G和CMC-U (CMC-为水溶性碳二亚胺修饰基团)以及所有 2′-O-甲基化的

表1 常用工具酶及其性质^*

名 称	类 型	底 物	产 物
RNase T1 RNase A RNase U2 RNase T2 RNase Phy 1	内切 内切 内切 内切 内切	-GpN- -PypN- -PupN- -NpN- -NpN-	Gp、-Gp Pyp、-Pyp PuP、-PuP Np Ap, -Ap, Gp, -Gp, Up, -Up，极慢产生C>P 和-C>P
RNase Phy M	内切	同上(限制性条件下只水解-ApN-和 -UpN-)	同上(限制性条件下只产生Up,-Up, Ap和 -Ap)
RNase M 核酸酶P1 核酸酶M 核酸酶S1 蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶 PNPase 磷酸单酯酶 多核苷酸激酶	内切 外切、内切 内切 内切 外切 外切 外切	-NpN- DNA、RNA DNA、RNA 单链DNA或RNA RNA、DNA RNA、DNA Pi+-NpN- pNpNp ATP+HoNpN-	Np pN Np pN pN Np ppN** 2Pi+NpN pNpN-+ADP

*Py、Pu分别代表嘧啶核苷和嘌呤核苷，N表示任一种核苷。
^**PNPase为多核苷酸磷酸化酶，它磷酸解RNA得到的最终产物中还伴有二核苷-磷酸或三核苷二磷酸。

表2 RNase A和RNase T₁的水解专一性^*

名称	水解RNA后产生的核苷酸	不能水解的核苷酸键
RNase A	Cp、Up、m5Cp、ac4Cp、 S2Cp、m5Up(Tp)、cmo5 Up、mnm5S2Up、m5S2 Up、S4Up、Dp、ψp	m3CpN、m3UpN和 nbt3UpN
RNase T1	Gp、Ip、Xp、m1Gp、m2G p、m22G>p	m7GpN、m1IpN、 QpN和WpN

*符号表示的核苷见“核糖核酸的化学组成”中的表。
核苷酸键。底物分子的构型对RNase T2的作用有较大影响，在水溶液中的聚腺苷酸较RNA分子中的腺苷酸难于为RNase T2水解，但在40%甲醇中则对聚腺苷酸的水解速度明显加快，可见具有高级结构的RNA分子是抗RNase T₂的。
5. RNase Phy I和RNase Phy M:来自多头绒孢菌的二种非特异性RNase。RNase Phy I能很快地水解除CpN键外的所有核苷酸键，由于它水解胞苷酸键的速度特别慢，人们将它与RNase A配合使用，以区别两个嘧啶核苷酸C和U。RNase Phy M的性质在通常条件下与RNasePhy I相同，即其水解二核苷一磷酸的速度如下： UpN>ApN>GpN>CpN;NpA>NpC>NpG>NpU。因此，CpU和CpC是最不易水解的。但在特定的条件下(7M尿素，pH5.0,50℃) RNasePhy M只水解UpN和ApN。因而较之RNase Phy I有更高的专一性，更有利于RNA序列分析。
核酸酶 一类既能水解RNA也能水解DNA的酶，其水解特性类似于磷酸二酯酶，产物通常为单核苷酸。这类酶已被用于结构分析的有核酸酶P₁、核酸酶M和核酸酶S₁。
1.核酸酶P₁:从橘青霉(Penicillium citrinum)中提取的一种核酸酶。它水解核酸产生5′核苷酸； 没有碱基专一性；最适pH为4.5～6.0，最适温度为70℃; 降解核酸时需锌离子。该酶兼有3′核苷酸酶活性，即能水解核苷酸或寡核苷酸的3′末端磷酸；作为3′核苷酸酶时它水解核糖核苷3′磷酸的速度比水解脱氧核糖核苷3′磷酸的速度快30倍。
2. 核酸酶S₁:从一种米麴霉菌中提取的一种单链核酸酶。它只水解单链核酸，不能水解天然的双链DNA；产物是5′核苷酸。水解DNA和RNA有相同的最适pH(4.5)；水解DNA 的活性能被RNA所抑制。该酶已被用于单链核酸的检定和核酸高级结构的测定。
外切核酸酶 一类水解核酸(包括DNA和 RNA)时从核酸分子的一端开始逐个地把核苷酸顺次水解下来的核酸水解酶。用于结构分析的这类酶有蛇毒磷酸二酯酶、牛脾磷酸二酯酶和多核苷酸磷酸化酶(PNPase)。
1. 蛇毒磷酸二酯酶 (SVPDase): 蛇毒中提取的一种外切核酸酶。从核酸的3′ 端开始逐个地将5′单核苷酸水解下来；既水解RNA也水解DNA，产物都是5′核苷酸；它水解变性DNA，也水解天然的双链DNA而且速度更快；对单链RNA的水解能很快完成； 能水解2′-O-甲基化的核糖核苷酸键，但水解速度比没有甲基化的慢一些。还能水解一个或二个核苷都是阿拉伯糖苷的二核苷一磷酸，可见糖基的性质对蛇毒磷酸二酯酶的水解活性影响不大。它对常见的四种核苷酸没有明显的碱基专一性，但对某些修饰核苷酸的水解速度与常见核酯酸不同，水解Tpψ非常慢，水解Cpψ的速度只有CpU的一半，经水溶性碳二亚胺修饰后的尿苷酸键不能被该酶水解。对底物的末端磷酸基有严格的要求，同一核苷酸片段如果5′端带磷酸根的则水解最快，去除5′端磷酸基则水解速度降低10倍，如果3′端带有磷酸根的则水解速度降低100倍(比5′端带磷酸根而3′端不带磷酸根的则慢1000倍)，可见5′端磷酸基促进水解，3′端磷酸基抑制水解。
2. 牛脾磷酸二酯酶 (SPDase):从牛脾中提取的一种外切核酸酶。它水解RNA或DNA是从核酸分子的5′端开始逐个顺次地产生3′核苷酸。在pH4.8时不能水解5′端带有磷酸根的tRNA，但能很好地水解5′ 端脱去磷酸根的tRNA; 在pH6.2时，能水解5′端带有磷酸根的tRNA，但其水解速度低于脱磷的tRNA，可见5′端磷酸根会抑制或降低其水解速度。水解活性对底物的二级结构敏感。能水解许多碱基上修饰的核苷酸和2′-o- 甲基化的核苷酸，但不能水解2′-O-乙酰化的核苷酸键，也不能水解2′,3′-环状磷酸。
其他工具酶 核酸结构分析中常用的工具酶还有磷酸单酯酶、多核苷酸激酶和-RNA连接酶等。
1. 磷酸单酯酶(PMase):水解磷酸单酯产生无机磷的一类酶。PMase有非特异性磷酸单酯酶和特异性磷酸单酯酶二类。非特异性磷酸单酯酶如大肠杆菌碱性磷酸酯酶，能水解单核苷酸或寡核苷酸的3′或5′末端磷酸单酯酶，产生无机磷。它也能水解核苷-2′-磷酸单酯、核苷二磷酸、核苷三磷酸、糖磷酯、对硝基酚磷酸和焦磷酸等范围广泛的磷酸单酯化合物。此外，它还能水解硫磷酯。大肠杆菌碱性磷酸单酯酶有很高的催化活性，已被广泛地用于核酸研究的各个方面。
非特异性磷酸单酯酶还有哺乳动物的肠粘膜、肾脏、肝脏和胎盘的碱性磷酸酶等。
特异性磷酸酶有5′核苷酸酶和3′核苷酸酶，它们分别特异性地水解核苷酸或寡核苷酸的5′磷酸单酯键和3′磷酸单酯键，产生无机磷。用于核酸结构分析的有大肠杆菌5′核苷酸酶和蛇毒5′核苷酸酶等。大肠杆菌5′核苷酸酶还能水解ATP、UTP、GTP和UDPG 等。水解核苷单磷酸的相对速度是： A>G>C>U>I。
3′核苷酸酶有黑麦草、麦苗、绿豆和微生物等多种来源的制剂，它们特异性地水解核苷酸或寡核苷酸的3′磷酸根。
2. 多核苷酸激酶(PNKase): 催化三磷酸腺苷上磷酸根转移到核酸、寡核苷酸和3′核苷酸的5′羟基上的反应的酶。T4 PNKase是T4噬菌体感染大肠杆菌产生的多核苷酸激酶，它能催化ATP上的γ磷酸根转移到核酸或寡核苷酸片段以及3′核苷酸的5′ 羟基上的反应，产生ADP。能作用于DNA，亦能作用于RNA; 作用于DNA的速度比RNA快。催化各种寡核苷酸磷酸化的速度取决于寡核苷酸的链长、组成及其糖基的种类，一般情况下，磷酸化3′单核苷酸的速度是寡核苷酸的2～5倍。T4噬菌体感染的大肠杆菌多核苷酸激酶伴有3′核苷酸酶的活性，它的激酶活性的最适pH为6.5～8.5，而3′核苷酸酶的最适pH为5.9，该酶水解脱氧核糖核酸3′磷酸的速度比水解核糖核酸的更快。已经从T4 噬菌体突变株感染大肠杆菌中制得了不含3′ 核苷酸酶活性的激酶。多核苷酸激酶的催化活性是可逆的，当存在有寡核苷酸的5′磷酸根、ATP、ADP时，该酶能催化ATP上的γ磷酸根与5′磷酸根的交换反应。多核苷酸激酶已被广泛用于核酸的结构研究。
RNA一级结构测定的方法 RNA一级结构测定方法分片段重叠法和直接阅读法两大类。前者为经典方法；后者是由DNA顺序分析法衍生而来的快速简便的新技术，它的问世仅几年时间，已经使RNA一级结构研究出现了崭新的局面。
片段重叠法 测定包括蛋白质在内的生物大分子一级结构的一种方法。其原理如下： RNA 分子被二种以上的具有不同碱基专一性的核糖核酸酶水解成各种寡核苷酸片段；然后分别分离和检定水解产物，并测定其核苷酸顺序及其相对含量； 二种不同专一性的酶得到的二组寡核苷酸片段是相互交搭的。利用这个原理，使用更多种专一性不同的酶水解RNA分子，解析结构的能力就更强。例如现在要解ABCDCAD这个顺序，有两种酶可供使用，一种专水解A和B；另一种专水解D。结果如下：
水解A和B: A↓B↓CDCA↓D →A+B+CD CA+D
水解D: ABCD↓CAD →ABCD+CAD
这样就可以根据得到的二组水解产物推断出序列是ABCDCAD。因为第一个酶解产物中有CDCA序列，说明该序列是片段中存在的；第二个酶水解得到ABCD和CAD二个片段，其排列有二种可能性即ABCDCAD 和CADABCD，因为前者有CDCA序列，故前者是正确的序列。
直接阅读法 利用特异性降解（酶或化学试剂）或在控制条件下合成得到的以RNA分子中某种特定碱基(如A)为末端(3′端或5′端) 的不同链长的寡核苷酸片段混合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳按链长分离，凝胶电泳上显示的各条带的链长就表示RNA分子上各个A碱基的位置(通常是同位素标记的或末端同位素标记的样品，则可用放射自显影法显示条带)。同样亦可得 G、C和U接尾的各组片段，并定出它们在RNA分子中的位置。由此可以很快排出RNA分子的核苷酸序列。这就是直接阅读法的基本原理。
此外，由于DNA序列分析方法的迅速发展，还可以用测定cDNA的方法测定RNA的结构。