基因的分离
进行基因的体外重组，首先要分离目的基因。所谓目的基因就是要进行基因重组的对象，例如胰岛素的基因、生长激素的基因或血红蛋白基因等。它们都属于染色体DNA上的结构基因。但是基因工程最终是把重组的基因在一特定的寄主细胞中表达。因此除了分离特定的结构基因之外，还需要了解基因表达的调控规律，即要分离调节基因。
基因实质上就是染色体DNA上一段特定的核苷酸序列，这段序列包含了细胞中某种蛋白质或酶或RNA的完整的遗传密码。分离基因存在许多困难。首先是基因种类繁多。简单生命物质——DNA病毒就含有近十种基因至数百种基因，原核生物有几千种基因，真核细胞的基因数目则由上万个至几万个。而如此众多的基因，其化学结构均由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)四种核苷酸组成，理化性质也十分相近，因此采用一般的物理、化学方法不易将它们分开。其次是基因本身的复杂性。对于真核细胞来说，基因不仅包括了全部编码区（外显子），而且还包括了间隔于编码区之间的非编码区部分（内含子）。造成基因分离困难的第三个因素是细胞内每种基因的含量极少，不论是原核还是真核细胞，大多数的结构基因都是单拷贝，例如珠蛋白β链有146个氨基酸，相当于约500个碱基对(bp)的长度，它在细胞染色体DNA的2.9× 109bp中所占比例极小(1.7×10-7)。最后的困难则是如何检测被分离的基因，证明它确是所需要的基因。尽管如此，近年来还是提出了一些分离某些特殊基因的方法，例如利用氯化铯密度梯度平衡超速离心法把GC配对含量高的基因和GC含量低的基因片段分开。有人曾用此法分离爪蟾中的5sDNA。再如大肠杆菌乳糖操纵子的分离是用携带乳糖操纵子方向相反的两种特定噬菌体完成的。当把来自此两种噬菌体的DNA单链进行退火时，两条链上的操纵子部分核苷酸重新借助氢键组成双链，DNA链的其余部分则松散开，然后藉单链核酸酶将松散的单链切除，留下的双链部分即是乳糖操纵子的基因。在真核细胞染色体DNA中，DNA(核糖核蛋白体RNA的基因，有数百次重复)、5sDNA(5sRNA基因，重复上万次)、tRNA(tRNA基因)和组蛋白基因均为多拷贝基因，分离就相对地容易些。下面介绍一些常用的分离和检测基因的方法。
基因分离方法
1. 鸟枪法又称溜散弹射击法。这是用限制性内切酶或者超声波破碎的方法把染色体DNA打断成一定大小的片段，通过T4DNA连接酶把它们与载体DNA（如质粒或噬菌体载体）相连，形成带不同基因片段的许多重组体DNA，将这些重组体DNA转入受体菌中进行繁殖，便可得到一大批含重组体的转化菌株（以质粒作载体）或重组噬菌体(以噬菌体DNA为载体)。然后再用合适的探针进行筛选，例如用放射性标记的纯mRNA或DNA片段作探针进行原位杂交，或者利用特定基因营养缺陷型的受体菌筛选。
2. 从基因库中筛选和分离基因。所谓基因库是一群含各种基因片段重组体的菌株，它是在鸟枪法基础上发展起来的。基因库基本上包含了染色体DNA所有的基因(约99%)，因此理论上可从基因库筛选出所有的基因片段。
3. 由mRNA反转录成相应的基因片段。因为真核基因的结构非常复杂，一个完整的结构基因编码区会被数个插入序列（内含子）所分隔，这样用直接由染色体DNA中分离到的基因片段连于运载体上进行基因表达研究会造成困难。所以目前更多的是由mRNA通过反转录酶被反转录成相应的DNA片段进行克隆及表达研究。由mRNA反转录成的DNA，因为其核苷酸序列完全互补于mRNA的mRNA的核苷酸顺序，因此称反转录的DNA为互补于mRNA的DNA,cDNA。早期，人们先从总mRNA中分离纯化某特异mRNA，再进行反转录合成cDNA，可是许多mRNA的含量均很低，极难分离纯化到足量的mRNA，因此现在大多采用cDNA库的方法，即用总的mRNA反转录成cDNA，把cDNA克隆到合适运载体之中组成cDNA库，然后从cDNA库中再筛选出所需基因。值得一提的是表达运载体的应用，使之可直接由表达产物——蛋白质的相应抗体进行克隆筛选。cDNA库已成为极有用的分离基因方法 (参见“cDNA库”)。
4. 基因片段的人工合成。DNA序列测定揭示了基因的一级结构，为人工合成基因提供了信息； DNA化学合成技术的迅速发展，尤其是DNA合成仪的出现，使之有可能人工合成基因片段。此外，蛋白质纯化和氨基酸序列分析技术的发展，提供了肽链上某一段包括活性中心部分的氨基酸序列，这也使人工合成相应基因片段成为可能。人工合成基因是DNA重组技术中提供外源基因的重要途径之一。80年代初，一些多肽类激素的基因工程中不少插入基因是化学合成或是部分合成得到的。譬如生长激素释放抑制因子在大肠杆菌中的克隆和表达用的重组基因就是由八段合成的寡核苷酸经过连接酶拼接而成的。人生长激素的克隆用基因是由合成片段(与激素中1～24位氨基酸相应的核苷酸片段)和双链cDNA(相应于24～191位氨基酸序列)拼接而成的(Olson et al,1981)。
基因检测 由人工合成法提供的基因基本上可直接用于克隆，而从鸟枪法的克隆、基因库或cDNA库中筛选分离的基因则必须进行检测，即分离所得基因准确无误地就是所需基因。常用的检测方法有以下几种。
1. 物理化学法。包括合适探针的分子杂交，分子杂交的电镜图谱，密度，融点(Tm值测定)以及限制性内切酶酶切图谱的分析等。
2. 生物功能法。用无细胞蛋白质合成体系得到相应基因的mRNA翻译产物，即多肽链，并对其作生物功能分析，包括免疫性能检测、酶活力检测、激素功能检测等等。
另一种生物学功能检测法是采用特定基因缺陷型受体进行基因功能的检测。例如大肠杆菌色氨酸合成基因可以选用色氨酸基因缺陷型菌株为受体菌。