临床细菌学检验

病原性细菌能引起多种感染和传染病，其诊断除可根据临床症状、体征和一般化验外，采取合适的临床标本进行细菌学检验在确证病原体上极为重要。下面介绍细菌标本的采集、送验和检验等。
标本的采集和送验 下列几个原则是否遵守，常直接关系到病原菌检出的成败：
❶采取标本时应注意无菌操作，尽量避免杂菌的污染，
❷根据不同病原菌在机体内分布、繁殖和排出的部位，采取不同的标本。例如流行性脑膜炎患者取瘀点、血液或脑脊液；伤寒病人在发病1～2周内取血液，2～3周时则取粪便和尿液等。
❸采取标本应在使用抗菌药物前，否则这种标本在分离培养病原菌时要加入药物对抗剂。例如曾使用磺胺药者的标本须加入对氨基苯甲酸，青霉素者须加入青霉素酶等。又采集的局部病变处，不得用消毒剂，必要时宜以无菌生理盐水冲洗、拭干后再取材。
❹尽可能采集病变明显部位的材料，例如采集痢疾患者沾有脓血的粪便，结核病人干酪样痰液等。
❺标本必须新鲜，采集后尽快送检。
❻在送检过程中，不耐寒的脑膜炎球菌等要保温，多数菌可冷藏输送，粪便标本必要时尚需加入甘油缓冲盐水保存剂。
❼检材容器上贴上标签，并在相应化验单上详细填写检验目的、标本种类及临床诊断，以供检验室参考。
标本的检验程序 主要有直接涂片镜检、分离培养和生化反应、血清学试验等鉴定。有的尚需作动物试验、药敏试验等。近年来发展的细菌学快速诊检技术尚有气相色谱技术、放射测量法、阻抗法、微量量热法等。
(1) 直接涂片镜检： 在形态和染色性上具有特征的病原菌，直接镜检有助于诊断。例如痰中查见抗酸性结核杆菌，脓液中发现革兰阳性的葡萄球菌，咽喉假膜中见有异染颗粒的白喉杆菌等。对形态和染色性无特征的革兰阴性肠道杆菌，又含病原菌较少（如血液）或杂菌太多（如粪便）的标本，则须进行分离培养出病原菌再进一步检定。直接涂片后，亦可用荧光标记的免疫诊断血清（特异性抗体）对待测病原菌（抗原）进行快速特异鉴定。
(2) 分离培养：原则上所有标本均应作分离培养。若在血液、脑脊液等原为无菌部位采集的标本，可直接接种至营养丰富的液体或固体培养基。有正常菌丛的部位所取之材，则应接种至选择性或鉴别培养基。疑有病原性芽胞菌存在的标本，可先在85℃水浴中经10分钟以杀死无芽胞的杂菌。培养的温度一般是37℃，经16～20小时孵育大多可生长茂盛或形成菌落。个别如布鲁杆菌、结核杆菌等繁殖速度较缓慢，分别需3～4周、4～8周才长成菌落。脑膜炎球菌、牛型布鲁杆菌等初次分离培养时需5～10%CO2。分离培养的阳性率一般比直接涂片镜检为高，但需时较久，因此遇到白喉等急性传染病时，可根据病人临床症状及有关化验资料作出初步判断并及时治疗，不必等待分离培养结果，以免贻误时间。
(3) 生化试验： 细菌的代谢活动依靠各种酶系统来催化。不同病原菌具有不同的酶，故其代谢产物不尽相同，利用此类试验可对某些病原菌进行鉴别。生化试验种类很多，特别是分解各种碳水化合物、蛋白质以及生物氧化的酶和产物的测定。常用的有糖类发酵、吲哚、甲基红、VP、枸橼酸盐利用、H2S产生、尿素分解、明胶液化、硝酸盐还原、触酶、氧化酶等试验。
(4) 动物试验： 实验动物在临床细菌学检验中主要用于分离和鉴定病原菌，测定细菌毒力、制备免疫血清等。常用的有小白鼠、豚鼠、家兔等。为使试验正确、可靠，必须按实验要求，选择一定的体重和年龄、体质健康、具有高度易感性的动物。接种途径有皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉等。接种后应仔细观察动物的食欲、精神状态和局部变化，有时尚要测量体重、体温及血液学指标。若死亡，应立即解剖，检查脏器有无病变或进一步作分离培养，证实由何病原菌所引起。常用的实验动物试验有用小鼠测定肺炎球菌的致病性，豚鼠或家兔测定白喉菌株产毒性和豚鼠结扎肠段测定致病性大肠杆菌的肠毒素等。小鼠等动物的正常体温、血液学常数等见表1。

表1 常用实验动物的体温及血液学常数

	体温 (℃/肛表)	红细胞 (百万/mm3)	白细胞 (千/mm3)	白细胞分类(%)
				中性	淋巴	大单核	嗜酸性	嗜碱性
小白鼠 大白鼠 豚鼠 家兔 绵羊 鸡	37.4～38.0 37.5～38.5 38.5～39.2 38.5～39.5 38.5～39.0 41.0～42.5	8.0～11 7.0～10 4.5～6.8 4.5～7.0 8.0～14.7 1.6～4.5	3～22 6～16 5～23 3～12 4～10 16～40	32 25 26 30 35 27	60 67 66 60 58 50	0.5 1 5 0.2 3 6	1 2 6 1 4.5 4	0.5 0.7 1 5 0.6 3

(5) 药物敏感试验： 测定标本中致病菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药，及时有效地控制感染具有重要意义。细菌敏感度的测定方法很多，有纸碟法、小杯法、凹孔法和试管法等。常用的是单片纸碟法和试管稀释法。前法是取经6小时孵育的试验菌肉汤培养物(生长缓慢者用18～24小时培养物) 均匀涂布于琼脂平板表面，然后以小镊子夹取沾有不同抗菌药物的圆形小滤纸片贴于平板面，各片间隔一定距离。37℃孵育过夜，取出观察结果 (表2)。试管稀释法是先将测试抗菌药物作一系列倍比稀释，然后各管加入经适当稀释的试验菌液，摇匀后经37℃孵育16～18小时后取出，读取结果，以抗菌药物最高稀释度仍能抑制细菌生长者，该管含药浓度即为试验菌株的敏感度(表3)。

表2 单片纸碟法药物敏感试验

	每片含药量	抑菌圈直径(mm)
		敏感	中度敏感	耐药
青霉素G	10U
葡萄球菌 其他细菌		>29 >22	21～28 12～21	<20 <11
氨𦭌青霉素	10μg
肠杆菌科细菌、肠球菌 葡萄球菌 其他细菌		>14 >29 >22	12～13 21～28 12～21	<11 <20 <11
羧𦭌青霉素	50μg
假单胞菌 变形杆菌、大肠杆菌		>15 >23	13～14 18～22	<12 <17
甲氧苯青霉素 乙氧萘青霉素 苯唑青霉素 链霉素 四环素类 先锋霉素Ⅰ 先锋霉素Ⅱ 氯霉素 氯林可霉素 红霉素 庆大霉素 卡那霉素 林可霉素 新霉素 新生霉素 竹桃霉素 万古霉素 多粘菌素B 磺胺药 利福平	5μg 1μg 1μg 10μg 30μg 30μg 30μg 30μg 2μg 15μg 10μg 30μg 2μg 30μg 30μg 15μg 30μg 300U 300μg 5μg	>14 >13 >13 >15 >19 >18 >16 >18 >16 >18 >15 >18 >15 >17 >22 >18 >12 >12 >17 >25	10～13 11～12 11～12 12～14 15～18 15～17 12～15 13～17 12～15 14～17 13～14 14～17 10～14 13～16 18～21 14～17 10～11 9～11 13～16 —	<9 <10 <10 <11 <14 <14 <11 <12 <11 <13 <12 <13 <9 <12 <17 <13 <9 <8 <12 <24
呋喃妥因	300μg	>19	15～18	<14

表3试管稀释法药物敏感试验*

*除青霉素、多粘菌素B为U/ml外，其余均为μg/ml

(6) 血清凝集试验： 本试验是临床细菌学检验中常用的特异性鉴定方法，主要用于鉴别病原菌的属、种和型。方法是用已知的免疫诊断血清与分离培养出的未知纯种细菌进行凝集试验，如出现阳性反应，即可确定该菌的属、种或型。
(7) 其他鉴定法：
❶噬菌体分型：葡萄球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等可用相应的型特异噬菌体进行分型，对流行病学调查有重要意义。
❷细菌素分型：某菌株产生的细菌素，对同种异株或同属，甚至异属某些菌株具有杀菌作用，借其杀菌谱不同，可用于分型。
❸DNA碱基组成相似性分类法：此为较新的分子生物学鉴定技术，根据测得待查病原菌DNA分子中G+C相对含量进行分类。例如志贺菌属G+C含量为50～52%，霍乱弧菌为48～50%等(参见“细菌的分类”条)。
临床标本中可能检出的病原菌见表4。

表4 临床标本中可能检出的病原菌

	病 原 菌
菌血症、败血症：血液、骨髓	金黄色葡萄球菌、A族链球菌、甲型链球菌、肺炎球菌、沙门菌属、大肠杆 菌、类杆菌属、李斯德菌属、流感嗜血杆菌等
肠胃道感染：粪便、肛拭或血液	沙门菌属、志贺菌属、肠毒素型大肠杆菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、胎儿 弯曲弧菌、耶尔森菌属、类杆菌属等
泌尿道感染：尿 生殖道感染：男性尿道分泌液、前列 腺液，女性宫颈拭、阴道分泌液	大肠杆菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、D属链球菌（肠球菌）、绿脓杆菌等 淋球菌、杜克嗜血杆菌等
呼吸道感染：鼻咽拭、痰液	肺炎球菌、A族链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、结核杆菌、百日 咳杆菌、肺炎杆菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌等
创伤感染：脓液 眼部感染：脓液 中耳感染：脓液 骨、关节感染：脓液	金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、破伤风杆菌、气性坏疽病原菌、绿脓杆菌等 摩拉杆菌、淋球菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、绿脓杆菌等 肺炎球菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌属等 金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、淋球菌、肺炎球菌、肠杆菌科、流感嗜血杆 菌、结核杆菌等
食物中毒：剩余食物、呕吐物、粪便	沙门菌属、金黄色葡萄球菌、肉毒杆菌、产气荚膜杆菌、副溶血性弧菌等