食品中琥珀酸及其盐类的测定方法

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化学名：丁二酸(Succinic Acid)

结构式：

分子式：C₄H₆O₄

相对分子质量：118．09

琥珀酸盐类

化学名：琥珀酸钠(Monosodium Succinate)

结构式：

分子式：C₄H₅N_aO₄

相对分子质量：140．07

化学名：琥珀酸二钠(结晶)(Disodium Succinate)

结构式：

分子式：C₄H₄Na₂O₄·6H₂O

相对分子质量：270．15

化学名：琥珀酸二钠(无水)(Disodium Succinate，Anhydrous)

结构式：

分子式：C₄H₄Na₂O₄

相对分子质量：162．06

食品中琥珀酸及其盐类，用气相色谱法测定琥珀酸的三甲基硅烷体，或用琥珀酸硫代激酶、丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶的酶化学法，进行定量。如需计算出各种盐类，必须乘以相对分子质量比。

由于食品中存在天然的琥珀酸，所以测定值应为食品中天然的和添加的琥珀酸总量。

(一)气相色谱法

同本章第二节“三、食品中柠檬酸及其盐类的测定方法(一)”。但测定条件中，柱温改为120℃。计算按式(1－11)进行：

式中 ρ——样品溶液中1mL相当于琥珀酸微克数，μg／mL

m——取样量，g

琥珀酸钠含量(g／kg)=琥珀酸含量(g／kg)×1．186

琥珀酸二钠(结晶)含量(g／kg)=琥珀酸含量(g／kg)×2．288

琥珀酸二钠(无水)含量(g／kg)=琥珀酸含量(g／kg)×1．372

(二)比色法

1．原理

用琥珀酸硫代激酶、丙酮酸激酶及乳酸脱氢酶的酶法测定琥珀酸，其反应式如下：

由于氧化而使NADH的减少量与琥珀酸量相当，故可用来进行琥珀酸定量。按需要分别乘以相对分子质量比，即可标出各种盐类的量。

由于食品中存在天然的琥珀酸，所以测定值应为食品中天然和添加的琥珀酸总量。

2．试剂和溶液

2．1 肌苷－5′－三磷酸钠(ITP-Na₃) 分析纯。

2．2 甘氨酰替甘氨酸 特级。

2．3 甘氨酰替甘氨酸缓冲溶液 将2．4g甘氨酰替甘氨酸及600mg硫酸镁(含7个水分子)，溶于约50mL重蒸馏水中，用2mol／LNaOH溶液约5mL调节pH至8．4，再加重蒸馏水至60mL，此液保存于4℃，可稳定4周。

2．4 β－辅酶Ⅰ，还原型(NADH-Na₂) 分析纯。

2．5 辅酶A(CoA－Li₃) 分析纯。

2．6 磷酰烯醇丙酮酸氯化铵盐[PEP－(CHA)] 分析纯。

2．7 CoA／ITP／PEP混合液(辅酶A／肌苷－5′－三磷酸钠／磷酰烯醇丙酮酸氯化铵混合液) CoA60mg，ITP-Na₃60mg及PEP－(CHA)₃60mg溶解于6mL重蒸馏水中。本液保存于4℃，可稳定2周。

2．8 辅酶Ⅰ溶液 取45mg辅酶Ⅰ(NADH-Na₂)及80mg碳酸氢钠溶于6mL重蒸馏水中，此液保存于4℃，可稳定4周。

2．9 丙酮酸激酶／乳酸脱氢酶(PK／LDH)混合液 用市售品丙酮酸激酶3mg／mL、乳酸脱氢酶1mg／mL^[1]配制混合液。本品保存于4℃，可稳定1年。

2．10 琥珀酸激酶液(SCS液) 用分析纯琥珀酸激酶琥珀酸辅酶A盐合成酶(SCS5mg／mL)^[2]。本品保存于4℃，可稳定1年。

3．仪器

分光光度计。

4．测定方法

4．1 样品溶液的制备。

4．1．1 液状食品^[3]：准确称取10g以内样品，一般含琥珀酸2～40mg。将澄明无色或淡色样品加水至100mL，即为样品溶液。混浊样品，加约50～60mL水，过滤，用20～30mL水分数次洗容器及残渣，合并滤液和洗液，加水至100mL，即为样品溶液。深色样品，加约1／10样品量的聚酰胺或聚乙烯吡咯烷酮，必要时加20～30mL水，剧烈搅拌混匀，过滤，用40～50mL水分数次洗容器及残渣，合并滤液及洗液，加水至100mL，即为样品溶液。

4．1．2 固体食品：准确称取10g以内样品，一般含琥珀酸2～40mg。对于不含脂肪、蛋白质的样品(果子类)，将样品置于匀浆器中，加50～60mL水，于60℃加热，匀浆5min，过滤，用20～30mL水分数次洗容器及残渣，合并滤液及洗液，加水至100mL，即为样品溶液。对于含脂肪、蛋白质样品^[4]，加30～40mL水并加热至60℃，匀浆5min，于60℃加温15min，冷后，于冰箱中放置20min，过滤，用20～30mL水分数次洗容器及残渣，合并滤液及洗液，加10mL0．4mol／LHClO₄溶液，细心搅拌混匀，用2mol／LNaOH溶液中和，加水至100mL，冰箱中放20min，必要时过滤，即为样品溶液。

4．2 标准液的制备 准确称取1g琥珀酸，加水溶解至250mL。再取50mL此液，用1ml／LNaOH溶液调pH至8，加水至100mL，作为标准液(1mL相当2mg琥珀酸)。各取标准液1mL、5mL、10mL、15mL、20mL，分别加水至100mL，即标准曲线用标准液(此液分别含琥珀酸20μg／mL、100μg／mL、200μg／mL、300μg／mL、400μg／mL)。

4．3 测定方法。

4．3．1 测定条件：用紫外分光光度计，于波长340nm处测定吸光度。

4．3．2 测定：在2支试管中，分别标明A、B，按顺序各加入1mL甘氨酰替甘氨酸缓冲溶液、0．1mL辅酶Ⅰ溶液、0．1mL辅酶A／肌苷－5′－三磷酸钠／磷酰烯醇丙酮酸氯化铵混合液(CoA／ITP／PEP混合液)，充分混合后，于A管中加入0．1mL样品溶液、1．4mL水，B管中加入1．5mL水，再于A、B管中各加入0．05mL丙酮酸激酶／乳酸脱氢酶混合液(PK／LDH混合液)，搅拌混匀，于37℃保温5min，A管为样品管，B为空白管。

以水作参比，于波长340nm处，用1cm比色杯，分别测A、B管的吸光度E_A和E_B。再于A、B管中各加入0．02mL琥珀酸激酶液(SCS液)，搅拌混匀，20min后，同样测其吸光度E′_A及E_B。

计算出E_A与E′_A之差△E_A，E_B与E′_B之差△E_B，再求出△E_A与△E_B之差△E_T。

4．3．3 标准曲线：取标准曲线用标准液S₁、S₂……S₅各0．1mL代替样品溶液，按4．3．2步骤进行测定，计算出△Es₁、△E_s2……△E_s5，绘制标准曲线。

5．分析结果的表述

从标准曲线图中，查得样品溶液含琥珀酸的对应值(μg／mL)，按式(1－12)计算出样品中琥珀酸含量(g／kg)。

式中 ρ——样品溶液相当于标准液浓度，μg／mL

m——取样质量，g

琥珀酸钠含量(g／kg)=琥珀酸含量(g／kg)×1．186

琥珀酸二钠(结晶)含量=琥珀酸含量(g／kg)×2．288

琥珀酸二钠(无水)含量=琥珀酸含量(g／kg)×1．372

注：[1]将从兔肉中取出的结晶化酶混悬于硫酸铵溶液(3．2mol／L)中。

[2]从猪心脏提取，混悬于硫酸铵溶液(3．2mol／L)中，效价10U／mg。

[3]酱油、果汁等色深的样品，应脱色。酸性样品应调pH至8．0。澄明无色酒、果酒等不必除酒精。如为酸性应中和。葡萄酒要稀释，不脱色即可分析。

[4]豆酱、奶粉、火腿、腊肠、鱼肉制品、鱼、贝类、海带等加酱油调料煮熟的食品、干酪等。

(三)高压液相色谱法

同本章第二节“三、食品中柠檬酸及其盐类的测定方法(三)”。