琼脂凝胶沉淀(AGP)试验(以鸡传染性法氏囊病为例)

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(1)材料

①优质琼脂粉或琼脂糖。

②0．01M pH7．2 PBS(其中含8%的NaCl)。

③抗原：鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)抗原。

④阳性血清与待检血清。

(2)操作

①琼脂平板的制备：称取琼脂粉1．2g，置于150ml三角瓶中，然后加入100mlPBS液：加上棉塞后，在水浴中煮沸或微波炉中融化琼脂。待琼脂完全溶解后，在水浴中保持60℃，吸取3．5ml，在干净载玻片上浇板，或直接用三角瓶将琼脂浇于平皿中，冷却凝固，琼脂平板的琼脂厚度为3mm。

微量血凝(HA)试验表

该表结果：HA效价为1∶256。

微量血凝抑制(HI)试验表

该表结果：HA效价为1∶64。

②按图4－1打孔成梅花形，孔径约3mm，孔距5mm。

图4－1 琼脂凝胶沉淀试验梅花形图案

③加样：中央孔加IBDV抗原，外周孔2和5加阳性血清，1、3、4和6加待检血清。

④抗体效价测定：中央孔加抗原，外周孔加倍比稀释的血清，每一稀释度加一孔。

⑤将玻片或平皿置于湿盒中，室温或37℃扩散24小时，判定结果。

⑥结果判定：周围孔与中央孔之间出现沉淀线为阳性反应。以出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的琼扩效价。

(3)注意事项

①为防止琼脂平板发霉，可加入0．01%的硫柳汞(即硫柳汞占总量的0．01%)防腐。

②浇琼脂板时防止过薄或过厚。

③打孔时切忌活动琼脂以防琼脂胶与玻片之间出现空隙，加样后液体从孔底部流出。克服的方法：打孔完毕后，在玻片的另一面用酒精灯加热，用手背皮肤测试温度以觉得略烫为度，孔底即被封好。

④加样时应加满而不溢出，若样本溢出可及时用滤纸将滤出的液体吸净。

(4)应用 本试验操作简便，准确，快速和重复性好，在实践中得到广泛应用。在集约化养鸡场中常用于IBD、马立克氏病(MD)、禽脑脊髓炎(AE)、禽痘、传染性鼻炎、传染性支气管炎(IB)和传染性喉气管炎(ILT)的抗原或抗体的检测。

①IBDV抗体的监测：本试验既可用于监测种鸡IBDV抗体的效价，又可监测雏鸡母源抗体的水平以确定最佳首免日龄。按雏鸡0．5%的比例采血分离血清，用IBDV抗原和阳性血清进行测定，中央孔加抗原，外周孔加不同鸡的血清与阳性血清对照。如果鸡群在1日龄测定时阳性率不到80%，则应在10－17日龄首免。若阳性率达到80%以上，应在7－10日龄再进行监测一次，如果此次阳性率低于50%，应在14－21日龄首免，如果阳性率在50%以上，应在17－24日龄免疫。

②MDV抗原的检测：拔取待检鸡腿外部羽髓丰富的羽毛3－5根，剪去上部羽毛，只留髓根部分，在周围孔每孔插入1只鸡的3－5个髓根，中央孔加阳性血清。一般在24小时可判定结果。也可用MDV抗原检测血清中的沉淀抗体。

③AEV抗体的检测：用AEV抗原加入中央孔，周围孔加待检血清与阳性血清进行AEV抗体的检测。

④禽痘病毒抗原与抗体的检测：用已知阳性血清可检测病变皮肤，绒毛尿囊膜或白喉病灶中的禽痘病毒抗原。用标准抗原可检测血清中的沉淀抗体。

⑤传染性鼻炎抗体的检测：用鸡副嗜血杆菌制备的可溶性抗原可检测感染或接种菌苗2周后的血清抗体。此抗体可维持到11周以上。

⑥IBV与ILTV抗原或抗体的检测：用IBV抗原与ILTV抗原可分别检测出血清中IBV抗体与ILTV抗体。用二种病毒的阳性血清可分别检测到气管或喉头粘液中存在的IBV或ILTV抗原。