斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)

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(1)材料

①硝酸纤维素滤膜(NCM)。

②0．01M pH7．2PBS。

③吐温－20。

④3．3－二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)。

⑤NDV抗原液，NDV阴性对照液。

⑥鸡抗NDV阳性血清、鸡阴性血清及待检血清。

⑦酶标兔抗鸡IgG。

⑧马血清(或小牛血清)。

(2)操作 本试验介绍间接法Dot-ELISA，既可检测NDV抗原，也可检测抗体。

【检测抗原】

①NCM的处理：在NCM上划6×6mm的方格，然后在方格中央用笔尖圆尾端压成痕迹，置于蒸馏水中浸泡10分钟左右，取出晾干后备用。

②点样：取1μlNDV抗原液，在NCM圆圈内点样，同时设立阴性对照，自然干燥或37℃干燥。

③封闭：将NCM置于封闭液(0．01M pH7．2PBS加10%的马血清或小牛血清)中，37℃30分钟，用洗涤液(0．01M pH7．2PBS加入0．05%吐温－20)洗涤一次，每次3分钟。

④加鸡抗NDV阳性血清：将NCM置于鸡抗NDV阳性血清中，37℃作用1小时，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

⑤加酶标兔抗鸡IgG，37℃作用1小时，然后洗涤3－4次，每次3分钟。

⑥加底物溶液(0．05M Tris-HCl缓冲液100ml：DAB40mg：30%H₂O250μl)作用5－20分钟。

⑦终止显色：将NCM置于蒸馏水中浸泡2－3分钟。

⑧自然干燥或37℃干燥。

⑨观察结果。

【检测抗体】

①NCM的处理：同检测抗原(1)。

②点样：取NDV抗原液点样，自然晾干或37℃干燥。

③封闭：同检测抗原(3)。

④将待检血清做系列稀释1∶10，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600，同时设立阴、阳性血清对照。将点样后的NCM按点样格子剪成小块，置于上述稀释的血清及阴性、阳性对照血清中，37℃作用1小时，然后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

⑤⑥⑦⑧与⑨分别同时检测抗原⑤⑥⑦⑧与⑨。

附表 养鸡场主要疫病免疫监测和诊断技术一览表

说明：①本表中所例举的试验方法都是常用的或很有推广价值的血清学检测技术，其中的英文名称分别代表：HA——血凝试验；HI－血凝抑制试验；AGP－琼扩试验；WBPA——全血平板凝集试验；FA——荧光抗体技术；ELISA——酶联免疫吸附试验；Dot-ELISA——斑点酶联免疫吸附试验。

②表中的符号代表：++——用于诊断：++++——用于诊断与抗体水平的监测。

【判定标准】与阴性对照相同不呈现斑点者为阴性(－)；以斑点深棕色，背景白色，对比度清晰为强阳性(++++)；斑点浅棕色，对比度清晰为(++)；介于两者之间为(+++)；斑点较弱或点内有不均质的棕色点为(+)。

以出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的DotELISA效价。

(3)注意事项

①本试验中NDV抗原、血清及酶标抗体的稀释度应根据预试验来确定。

②本试验底物溶液中的供氢体是不溶性的DAB，根据斑点颜色也可选择其它供氢体，如4－氯－1－萘酚等。但绝不能使用可溶性供氢体。

③根据试验的目的确定检测抗原或检测抗体。

④封闭液既可使用异种动物血清，也可使用BSA或明胶进行封闭。应根据预试验选择最佳条件。

(4)应用 Dot-ELISA可进行常规ELISA所做的一切试验。应用方面参考实验5。