口蹄疫病毒感染相关抗原(VIA)琼脂免疫扩散试验操作技术

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(一)材料准备

1．Tris－盐酸缓冲液：可自行配制。

2．VIA抗原。见使用说明书。

3．标准阳性血清。见使用说明书，用前以56℃灭能30分钟。

4．被检血清。56℃灭能30分钟。

(二)操作方法

1．琼脂糖平板的制备。取琼脂糖1克，Tris－盐酸液100毫升，装入三角瓶中，于水浴煮沸使琼脂糖彻底融化，然后吸取7毫升琼脂液加到直径5．5厘米的平皿里，制成3毫米厚的琼脂板，待琼脂完全凝固后，加盖置于湿盒中，贮藏在4℃冰箱中备用。

2．打孔。用打孔器在琼脂板上按7孔型图案打孔，即1个中央孔，6个外周孔，孔的直径和孔边缘间距均为4厘米。

3．加样。按图2－1所示加样，中心孔加VIA抗原，2孔和5孔加口蹄疫标准阳性血清，1、3、4、6孔加被检血清。每孔样品加满为止。

图2－1 琼脂扩散沉淀线的判定

4．扩散。将加样的琼脂平皿盖上盖，置于湿盒内于室温(20－22℃)任其自然扩散。

5．观察。于24小时进行第1次观察，72小时作第2次观察，168小时作最后观察。观察时，可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须借助强烈光源才能看清沉淀线。

(三)结果判定 当2孔和5孔标准阳性血清与抗原中心孔之间形成沉淀线时，若被检血清孔与中心孔之间也出现沉淀线，并与阳性沉淀线末端相融合(图2－1中①、④孔)，则被检血清判为阳性。被检血清孔与中心孔之间虽不出现沉淀线，但阳性沉淀线的末端向内弯向被检血清孔(图2－1中⑥孔)，则被检血清判为弱阳性。如被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且阳性沉淀线直向被检血清孔(图2－1中③孔)，则被检血清判为阴性。