口蹄疫毒型鉴定的琼脂扩散试验操作技术

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(一)材料准备

1．琼脂基体的制备。

(1)将琼脂糖用含万分之一硫柳汞磷酸盐缓冲液(pH7．6)，配成1%的胶体，并使含氯化钠7．5%。

(2)选直径10厘米中性玻璃培养皿，将配好的琼脂糖溶化，加入皿内，厚度为0．3－0．35厘米，充分凝固后用打孔器作成直径0．45厘米的小孔5个(中间一个，上下左右各一个)，其孔间距离各为0．45厘米，然后用热琼脂糖补底。

2．待检材料的制备。

(1)水泡淋巴液：牛水泡一般出现在舌面、蹄冠、蹄叉及母畜的乳房部，采取时可在离水泡1－2厘米处刺入，穿入水泡中央吸出淋巴液。羊的水泡在上齿龈，猪在鼻镜及蹄部，往往未成熟即已破损，故应仔细采集。

(2)组织毒浸出液：采集的水泡皮或含毒组织用磷酸盐缓冲液作成1∶10的乳剂，置4℃浸出24小时，用3000转／分离心10分钟，吸出上清液用硫酸铵或高速离心机浓缩即成。

(3)痊愈血清：无菌采取牲畜痊愈15－60天的全血，并分离出血清。

(二)操作方法 中央孔内加入待检之抗原(或痊愈血清)约0．025毫升。周围4个孔分别加入已知各型标准血清(或标准抗原)各0．025毫升。

加完后，盖上皿盖，置浸有5%石炭酸湿纱布的磁盘内，放室温(25℃)扩散过夜，次日每隔4－6小时观察一次，并记录结果。

(三)结果判定 如在抗原孔与血清孔之间出现灰白色两条或一条较粗的沉淀线(大多偏于抗原处)，即可判定被检材料属于相应血清型。