乳酸脱氢酶(LDH)同功酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳

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同功酶是指同一种属中，由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体或聚体，同功酶的一级结构、理化性质和生理功能不同，而催化功能相同。

目前被研究的同功酶达60多种，同功酶参与机体的代谢调控，且有特殊的生理功能，同功酶表现出明显的组织，种属和发育的特异性，同功酶不仅是生理指标，而且也是遗传标志。在同功酶的研究中，电泳法被广泛应用。本实验采用垂直板型电泳(也可用垂直管型)，分析组织中乳酸脱氢酶同功酶。

试剂

(1)0．01M，pH7．4磷酸钠缓冲液：0．01M磷酸二氢钠19毫升和0．01M磷酸氢二钠81毫升混合即可(此液组织匀浆用)。

(2)凝胶贮液：

A液(pH8．9)：1N盐酸48毫升，三羟甲基氨基乙烷(Tris)36．3克，用水定容至100毫升。

B液：丙烯酰胺(Acr)15克，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．4克加水至50毫升。

(3)TEMED(四甲基乙二胺)。

(4)10%过硫酸铵(AP)。

(5)0．025%溴酚蓝－50%甘油。

(6)电泳缓冲液：称取Tris6克，甘氨酸28．8克加蒸馏水至1升，调至pH8．3。使用时亦可稀释10倍。

(7)LDH酶活性染色液：

NAD⁺(氧化型辅酶Ⅰ)5毫克／毫升 5毫升

NBT(氯化硝基四氮唑蓝)1毫克／毫升 15毫升

PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)1毫克／毫升 1毫升

1M乳酸钠 5毫升

0．5MTris／毫升缓冲液(pH7．0) 7．4毫升

0．1M NaCl 2．6毫升

加双蒸水至50毫升。

(8)固定脱色液：7%乙酸。

(9)保存液：20%乙醇－2%甘油。

仪器

(1)中压电泳仪，垂直板型电泳槽。

(2)冷冻高速离心机。

(3)恒温水浴。

(4)玻璃匀浆器。

(5)注射器(10毫升、1毫升)注射针头(20号、6号)。

(6)微量进样器。

操作步骤

1．电泳槽的安装：垂直板电泳槽，目前最普通的是用有机玻璃制成的两个“半槽”。并由两个“半槽”组成方形电泳槽。两半槽之间夹着凝胶模了，通过长螺丝将两个半槽固定在一起。凝胶模子的两侧形成前、后两个槽，供装电极缓冲液和冷却管用。凝胶模子由一个压制成“”形的硅酮橡胶制成的夹套和两块长短不等的玻璃片。另外还有样品槽模板组成。

夹套内侧有两条凹槽，可将两块相应大小的玻璃片嵌入槽内。玻璃片之间形成一个2～3mm厚的间隙。当制胶时，即将胶灌入其中。将玻璃片嵌入凹槽时，长玻璃片下部与胶带保持2～3mm的距离。以使此端的凝胶与一侧的电极槽相通，电泳槽装好后，灌胶前，可先向凝胶模底部背面槽内的小池中灌入用电极缓冲液配制的1．5%琼脂，使在胶池的下部凝结成约0．5厘米厚的琼脂层。待琼脂凝固后，即堵住凝胶模下面的窄缝，同时通电时又可作为盐桥。然后再将聚丙烯酰胺凝胶液，灌在它上面。

另一较短的玻璃片，其三个边嵌入夹套中，因这一玻璃片稍低于前者，可使另一侧的电极液由此片玻璃顶部没过，使凝胶顶部与电极槽相通。

2．凝胶系统：垂直板型电泳的凝胶系统有两类：①不连续系统，主要用于蛋白质的分离。②连续系统：只有一层凝胶，一种pH和一种缓冲系统，将样品透析或稀释，使样品的电导很低，这样人工造成的电位梯度差异，也可使样品浓缩，达到同样分辨力。近年来在蛋白质和核酸的凝胶电泳研究中，广泛使用这种连续系统。

3凝胶的制备：聚丙烯酰胺凝胶连续系统(7．5%浓度)的配方如下：吸取A液2．5毫升，B液5毫升，TEMED0．01毫升，水12．39毫升，混匀。抽气十分钟(本实验将此步省略并不影响实验结果)。再加入10%过硫酸铵0．1毫升，混匀，用注射器将以上制备的胶液注入胶模中，注意不要产生气泡。将胶液加到距玻璃板顶端约1cm处，然后把样品槽模板插入胶液顶部，插入样品槽模板是为了在凝胶顶部形成数个互相隔开的凹槽，电泳前，将样品液加在这些凹槽中。

凝胶聚合作用，约0．5～1小时，控制聚合时的温度应与电泳时的温度相同。凝聚后小心地将样品槽模板取出，于两侧电极槽中充满电极缓冲液。

4．乳酸脱氢酶的提取：取活草鱼，将其心，肝胰脏、肠、肌肉，用生理盐水洗去组织血污，称取以上组织0．1～0．5g加20～40倍体积的0．01M，pH7．4，磷酸钠缓冲液，置匀浆器中，于冰浴上匀浆。匀浆液经10000×g离心20分钟。取上清液，在4℃冰箱中保存备用。

5．加样：LDH酶提取液同溴酚蓝－甘油以4∶1混合后，用微量注射器加入电泳板胶的样品槽内，加样量为10～15微升／#(即每个样品槽内加10～15微升)。

6．电泳：电泳时，控制电流强度为2毫安／井，电压200伏特，室温下电泳4小时。

7．染色：电泳完毕后，将电泳凝胶取出，置LDH酶活性染色液里，37℃水浴保温20分钟，可显示出清晰的蓝紫色区带。

染色后的胶板用双蒸水漂洗2次，在7%乙酸中固定十几小时。

8．标本的保存：胶条浸在20%乙醇－2%甘油中，密封保存。

胶板用7%乙酸－2%甘油浸泡1小时，然后用预先浸泡过7%乙酸－2%甘油的玻璃纸，铺在玻璃板上，移入凝胶板，再用玻璃纸把胶板覆盖密封，不可有气泡，在室温下风干，制成透明胶片保存。

9．记录：将LDH同功酶电泳图谱照像或画出线条图。

10．定量∶用光密度自动扫描仪描记电泳区带的扫描曲线。求出各吸收峰面积，计算LDH同功酶各组分的相对含量。

由于同功酶分子结构的差异，分子大小形状的不同，在一定pH缓冲液中所带电荷不同，因此，在电泳时，导致各同功酶组分的不同迁移率，可把各同功酶分离开，从正极到负极显示出LDH₁、LDH₂、LDH₃、LDH₄和LDH₅五条区带。

LDH的五种同功酶的生理功能不同，虽然都催化乳酸丙酮酸的反应，但LDH₁主要催化乳酸脱氢转变成丙酮酸，而LDH₅主要催化丙酮酸还原成为乳酸、不同生物LDH₁的含量不同，它们的含量依次为：鸟类＞爬虫类＞两栖类＞硬骨鱼类＞软骨鱼类。

比较各种组织的LDH同功酶电泳图谱和五种同功酶相对含量，可以观察到明显的组织特异性。