LDH同功酶亚带的薄层等电聚焦电泳

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等电聚焦(IF)是一种特殊的电泳方法，它是在60年代后期发展起来的，利用两性电解质载体，在电场作用下，形成连续的pH梯度，蛋白质按其等电点，聚焦在不同的位置，而达到分离的目的。

凝胶等电聚焦就是指用聚丙烯酰胺凝胶作抗对流支持介质的等电聚焦。

薄层等电聚焦电泳，是一种高分辨率分析技术。

试剂

(1)0．01M磷酸钠缓冲液(pH7．4)：0．01MNaH₂PO₄ 19毫升和0．01MNa₂HPO₄81毫升，混匀。用酸度计调节pH值至7．4。

(2)27．86% Acr溶液。

(3)0．87% Bis溶液。

(4)23%甘油。

(5)40% Ampholinc，pH3．5～10。

(6)TEMED。

(7)2%Ap。

(8)电极液：①正极液：2%硼酸溶液。

②负极液：0．5%乙醇胺溶液。

(9)LDH酶活性染色液：同LDH同功酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

仪器和器材

(1)中压稳流稳压电泳仪。

(2)薄层等电聚焦电泳装置。

(3)低温高速离心机。

(4)微量pH计电极。

(5)玻璃匀浆器，微孔滤膜(0．45μ)，微孔过滤装置。

(6)微量注射器(2毫升，10毫升)注射针头(8号)。

(7)大小号文具夹。

(8)玻璃板：(24×12×0．2cm)或(12×12×0．2cm)若干块，制薄层凝胶片用。

(9)“”形橡胶框〔外周大小(24×12cm或12×12cm)，框边宽5mm，橡胶片厚＜1mm。〕

橡胶片框也可用塑料硬薄片代替。

(10)琼脂：制胶封边用。

操作步骤

1．凝胶板的制备

(1)凝胶板模：将“”形橡胶框，置2块玻璃板之间，用几个文具夹夹住，制成1个制凝胶板的模腔。为避免凝胶溶液渗漏，可用琼脂封边。

(2)配制7．5%凝胶，配方如下：

27．86%Acr3．5毫升，0．87% Bis3．5毫升，23%甘油5．22ml，40%Ampholine(pH3．5－10)0．67毫升，TEMED12．5微升，混匀后抽气(经实验不抽气也可)，再加入2%Ap0．5毫升。总计13．40毫升。

(3)灌胶：

把配好的凝胶液吸入注射器中，直接灌入架好的板模腔中，灌胶时板模要保持倾斜，以免灌入的凝胶产生气泡。灌胶距顶端0．5cm。然后用水封。置室温下2小时即聚合成胶。将凝固的薄层胶片于4℃冰箱中放置1小时后备用。

2．LDH提取液的制备：取活鱼新鲜器官组织，用生理盐水洗去血污，按1∶10(克／毫升)比例加入0．01M，pH7．4的磷酸盐缓冲液，用玻璃匀浆器匀浆，经10000×g2℃离心20分钟，如上清液透度不好，可再经微孔滤膜过滤，滤液应是清亮的。可用于电泳。

3．加样：将胶板橡胶框拉去，小心揭去上层玻璃板，样品直接加在薄层胶片上。

加样的方法为：用一叠4层的擦镜纸，剪成4×5毫米2的小方块，浸入样品液中，再贴在胶片上，加样量大约10微升。

如果用的是一般水平式电泳槽(卧式电泳槽)在加样前，胶片的正负极，应用滤纸桥与正负电极液相通。

4．电泳：电泳在4℃冷室或冰箱中进行。电泳条件是：先加恒压，起始电压为60伏特。15分钟后调至120伏特。然后恒流，每厘米长的胶片约0．5～0．8毫安，当电泳1．5小时左右，电压上升到650伏特时，再转而恒压650伏特，维持24小时左右。当电流为零时，即可停止电泳。

5．pH梯度的测定：从电泳后的凝胶片上切下2厘米宽的胶片，再从正极端至负极端切成14等份，每份加0．5毫升双蒸水，搅碎后，用微量电极在pH计上测定它们的pH值。依所测pH值数据绘制出pH梯度曲线。

6染色：同功酶电泳区带用特异性染色法染色。当电泳结束后，取出凝胶片，置LDH酶活性染色液里，37℃水浴保温20分钟，可显示清晰的蓝紫色区带。染色后的胶板用双蒸水漂洗2次。在7%乙醇中固定保存2个月不褪色(置冰箱中保存)。也可制成干片。。

7等电点的测定：测量染色后分离的区带至正极端的长度，再根据pH梯度曲线找出相应的等电点。