遗传性代谢病的基因诊断

通过遗传病 （包括遗传性代谢病）的致病基因DNA分析，以达到诊断，即为基因诊断。
重组DNA技术的飞速发展，使基因结构，表达，调控与突变的研究，深入到核苷酸水平。遗传病的基因诊断也随之问世。基因诊断一般是在其他较简便或较经济的方法不能达到目的时，或其他方法取材不很安全时才被采用。因此，在现阶段，只限于某些遗传病(已获得有关的基因或与其紧密连锁的DNA序列者)的产前诊断或临床前诊断。
遗传性代谢病患者的诊断，通常是通过血液或尿中有关代谢物（如苯丙酮尿症患儿血中苯丙氨酸的含量）或异常代谢物 （如同型胱氨酸尿中的同型胱氨酸含量） 的测定，血液、红细胞、白细胞、皮肤成纤维细胞或其他组织细胞中有关酶(如Tay-Sachs病中血清、白细胞或成纤维细胞中的氨基己糖苷酶A，蚕豆病中红细胞的葡糖-6-磷酸脱氢酶，糖原贮积症Ⅰ型中肝细胞葡糖-6-磷酸酶)活性的测定，蛋白变异体（如异常血红蛋白）的检出，或血循环中蛋白质或酶(如α₁抗胰蛋白酶)的测定，而得以明确。但在产前诊断时，可供取材的羊水细胞或绒毛组织细胞中，有关基因不一定能得到表达，例如珠蛋白基因只在红细胞系统的细胞中能得到表达，在羊水、羊水细胞或绒毛细胞中则测不到基因产物。因此血红蛋白病的产前诊断，不可能通过通常的方法得以实现。在胎儿镜检查过程中，采集胎儿血，或肝脏，皮肤活检，进行有关检查，可以扩大产前诊断病种的范围，使血红蛋白病等可以得到产前诊断。但胎儿镜检查引起的流产风险过大(5～10%)，常不能为孕妇所接受。基因DNA分析取材于羊水细胞或绒毛细胞的DNA，可以避免胎儿镜检查的风险，同样可以使血红蛋白病等得到产前诊断。原则上讲，只要能得到某种遗传病的基因DNA序列，或与该基因紧密连锁的DNA序列，就可以用它作为探针，对这种遗传病进行产前诊断。因此基因诊断有广阔的前景，并可用于其他方面，如临床前诊断，群体中杂合子的检出等。
原理 机体的每一个细胞都由同一个受精卵经过不断的细胞分裂与分化产生的，因此它们具有相同的基因组DNA。但由于分化的结果，一些基因只在某种细胞中得到表达，另一些则不能。如珠蛋白基因只在红细胞系统的细胞中能得到表达，在羊水细胞或绒毛细胞中则不能。但若检查羊水细胞或绒毛细胞所含珠蛋白基因DNA，仍可能发现胎儿是否带有珠蛋白的突变基因，从而作出正确的产前诊断。这就是产前基因诊断。

图1 Southern印迹法示意图

基因DNA分析须具备有关基因的DNA序列或与该基因紧密连锁的DNA序列作为探针，采用的方法即South-ern印迹法(图1)。首先自细胞中提取基因组DNA，用限制酶加以酶解，一般可获得不同长度的、分子量各不相同(以Kb为单位)的DNA片段约100万个。其中必然有一个片段含有我们要分析的单拷贝基因。通过琼脂糖凝胶电泳可将其分开，用碱处理变性后，将凝胶板取下，放在浸泡缓冲液的Whatman滤纸上，复以硝酸纤维素膜，上盖多层吸水纸，再压上重砝码。当缓冲液由于毛细管吸力通过凝胶板进入纤维素膜和吸水纸内时，会将凝胶上的DNA片段带到纤维素膜上。由于DNA与硝酸纤维素膜间的紧密结合，它将留在膜上。然后将纤维素膜在80℃烘干，以固定DNA。同时将基因探针通过缺口翻译。标上放射性³²P，以获得带有放射性的基因探针。用基因探针与膜上固定的DNA片段原位杂交，探针只与含互补序列的片段(即含有要分析的基因的DNA片段)杂交。洗去未杂交的探针，然后进行放射自显影，显现出的带即含有要分析的基因的片段。若在电泳时同时加入不同分子量的标准DNA片段，通过对比即可确定显影片段的分子量。
基因探针 特异的基因探针多为1～6Kb长的，与要分析的基因的部分序列互补的DNA序列。一般来讲，自人基因库内“钓”出的，含有全部内含子的完整的基因序列过大，不便于在质粒中克隆，且常与基因组DNA中其他序列杂交，因此并非完全特异，所以很少直接用它作为探针，通常选用其cDNA作为探针。制备cDNA的方法有几种。若某种细胞中有关基因的mRNA大量存在时，就可以直接提取mRNA，并加以纯化，然后通过反转录酶，合成其cDNA，如幼稚红细胞中的珠蛋白mRNA。若细胞中mRNA含量很低，则可用针对基因编码的蛋白质的特异抗体，免疫沉淀出进行翻译的mRNA，然后制备cDNA。有时用这种方法先从动物中获得相应的cDNA，然后用此cDNA从人基因库或cDNA库中“钓”出有关的基因序列。人的苯丙氨酸羟化酶基因（该基因的突变导致苯丙酮尿症）就是通过大鼠苯丙氨酸羟化酶的cDNA从人肝细胞基因库中“钓”出的，而大鼠的cDNA即是用上述的免疫沉淀法制备的。若基因编码的蛋白质的氨基酸序列，或部分氨基酸序列已搞清，就可以人工合成相应的寡核苷酸作为探针，从人的基因库或cDNA库中“钓” 出所要的基因序列或cDNA序列。人类的第Ⅷ凝血因子的基因探针就是如此制备的，并已用于血友病的产前基因诊断。
当要分析的基因所编码的蛋白质还不为人所知时，上述方法就不可行。此时若能找到一个DNA序列与该基因紧密连锁，则可以用它作为代替物，以进行基因DNA分析。例如，人们对Huntington舞蹈病致病基因（或其正常等位基因）的直接产物一无所知，但偶而发现人类基因库中一个编号为G8的DNA序列与此基因相连锁。虽然两者之间相距约10cM，连锁不十分紧密，在配子形成过程中有出现一定程度互换重组的风险，但仍可能用以进行产前或临床前基因诊断。下表列出了具有临床价值的DNA探针。

具有临床价值的DNA探针

致病基因的直接检出
1. 基因缺失： 若所用的限制酶的酶切位点在缺失部分之外，基因的缺失就很容易用Southern印迹法检出。例如亚洲所见各型α地中海贫血大多是由于α珠蛋白基因的缺失所致。Bart′s胎儿水肿是由于4个α珠蛋白基因全部缺失，图2所示。用EcoRI消化羊水细胞的基因组DNA，经Southern法印迹，用α珠蛋白基因探针杂交，再行放射自显影。正常胎儿显出含正常α基因的22.5kb带，Bart′s胎儿水肿无α基因，故不显带。其他由于基因缺失或部分缺失的血红蛋白病，如δβ地中海贫血，Hb Lepore，印度人中的一种β地中海贫血也可用同样的原理进行产前诊断。后者的基因组DNA片段长3.7kb，而正常胎儿中则出现4.4kb长的片段。
2. 点突变：若致病基因的点突变恰在某一限制酶的识别序列中，将导致这一酶切位点的丢失，从而Southern印迹法最后得到的带型将会不同于正常。镰形细胞贫血的Hbs，其β基因与β^A基因 (正常β基因)的不同，在于β^A基因的第6个三联体GAG经点突变而成为GTG，该处原有一个限制酶Dde Ⅰ的识别序列CTGAG，经点突变成为CTGTG后，这一Dde Ⅰ切点丢失了，因而最后的带型中，出现一条376bp的带，而β^A的175bp带丢失了。

图2 胎儿水肿的产前基因诊断

这一点突变也使限制酶Mst Ⅱ的一个切点CCTGAGG丢失，因而β^A基因的1.1kb带不见了，而出现一条新的1.3kb带。
Hb OArab的β^oArab基因是由于β^A基因的121与122两个三联体5′-GAATTC-3′经点突变成为5′-AAATTC-3′所致。5′-GAATTC-3′是EcoRI的切点，点突变后的βo^Arab基因，只产生一条8.4kb带，而β^A则有5.2与3.2kb的两条带。
其他如某些类型的β地中海贫血，胎儿血红蛋白持续增多症，血友病A,Lesch-Nyhan综合征等致病基因也可以用特定的限制酶直接检出。
寡核苷酸探针法直接检出点突变 上述的限制酶直接检出法有赖于能识别基因点突变所在序列的特定的限制酶。本法则有赖于能识别点突变所在序列的特异探针。这种方法首先须弄清在点突变的部位正常基因与突变基因的核苷酸序列间的不同。在这一基础上，可以人工合成相应的18～20寡核苷酸探针，用放射性同位素标记后，就可通过Southern印迹法进行检测。正常基因的相应寡核苷酸探针只与正常基因杂交，突变基因的相应寡核苷酸探针则只与突变基因杂交。图3示两种探针都可以与杂合子DNA杂交，因为杂合子既有正常基因，也有突变基因。这种方法已用于产前诊断β地中海贫血、镰形细胞贫血、α₁抗胰蛋白酶缺乏症、血友病A及胎儿血红蛋白持续增多症。
致病基因的间接检出 若基因突变不属缺失，或属点突变但不处于特定限制酶的识别序列，或其点突变的部位或性质尚未弄清，则不可能用上述的直接法检出。此时必须利用限制酶切片段长度多态性(RFLP)与有关基因的连锁分析法进行间接检出。但由于在某些患病家系中，有关基因的旁侧序列中不存在RFLP，或与突变基因连锁的RFLP单体型与正常基因连锁的单体型相同，无法鉴别，因而间接检出法不可能100%成功。

图3 利用寡核苷酸探针直接检出致病基因
左图示与正常基因相应的寡核苷酸探针所得的杂交带；右图示与致病基因相应的寡核苷酸探针所得的杂交带。N为正常人，C为致病基因携带者，A为致病基因的纯合子。

人的结构基因间的序列与其内含子的序列中常可出现点突变。由于它们不在基因的编码区，多不导致表型的改变，因此属于中性突变，但却可以成为有价值的个体标记，这就是人类基因组的DNA多态性。例如人类β珠蛋白基因簇所在的50kb区域内，几乎100～200bp中就可以出现一个点突变。这些点突变中的一部分恰巧位于某特定限制酶的识别序列中，因此易于检出，只要利用该限制酶酶解基因组DNA，具有还是不具有该点突变时产生的限制酶切片段长度将有所不同，也就是将表现出多态性，这些酶切位点多态性的组合就成为与该基因相连锁的单体型。例如人类β珠蛋白基因的5′旁侧有3个HincⅡ酶切位点表现有多态性，Hind Ⅲ有2个，Hinf Ⅰ有1个，在β珠蛋白基因内部Ava Ⅱ有1个，Hgi AⅠ有1个，在其3′旁侧序列中，HpaⅠ,Hind Ⅲ，与Bam HI各有1个。但不同的酶切位点所用的探针不尽相同。这些限制酶切位点的多态性的组合即成为与β基因相连锁的单体型。

图4 镰形细胞贫血的产前基因诊断
基因组DNA用Hpa Ⅰ酶解。在这个家庭中，βA的3′端一个Hpa Ⅰ切点存在，故得7.6kb片段。 β的3′端一个HpaⅠ切点丢失，故得13.0kb片段。据此进行产前诊断。

利用与致病基因紧密连锁的特异限制酶切位点多态性进行产前诊断 若某一限制酶切位点的存在经常与致病基因相连锁，而其缺失经常与其正常等位基因相连锁，那就可用以进行基因诊断，反之亦然。如Kan与Dozy首先发现在βA3′旁侧序列中的Hpa Ⅰ切点，当βA突变为β时，往往丢失，因而用该酶酶解基因组DNA后， 所得片段为13kb，而不是正常的7.6kb片段。
在非洲黑人中，60%的β^s基因与13kb片段相连锁，而只有8%的βA基因与之连锁。因此在某一个家系中，就很可能出现βs基因只与13kb片段连锁，βA基因只与7.6kb片段连锁。当胎儿细胞的DNA用此酶酶解后，根据所得片段的长度就能判断胎儿是否患病。βs基因经常与其3′旁侧序列中Hpa Ⅰ切点的丢失相连锁的现象，是连锁不平衡的一个例子，意思是它们间的组合不是随机的。

图5 利用限制酶切位点多态性的单体型与β地贫基因的连锁分析进行β地中海贫血的产前诊断

利用单体型与致病基因的连锁分析进行产前基因诊断若某一限制酶切位点的存在与否并不与特定基因呈连锁不平衡，在进行产前基因诊断时就必须利用单体型与致病基因的连锁分析。如图5中所示，β地中海贫血患儿为β地贫基因的纯合子（属常染色体隐性遗传），因此父母必定为杂合子。在这一家系中，β珠蛋白基因旁侧序列中的Hinc Ⅱ与Bam HI切点都表现有多态性。患儿既有Hinc Ⅱ，又有Bam HI切点的多态性。但Hinc Ⅱ切点只在母亲中，Bam HI切点只在父亲中表现有多态性。因此患儿的一个与Hinc Ⅱ(-)相连锁的β⁰ (β地贫)基因必定来自其母，与HincⅡI(+)相连锁的必定来自其父； 与Bam HI(-)相连锁的^β0基因也必来自其母，与Bam HI(+)相连锁的必定来自其父。也就是说，与患儿两个β0基因相连锁的单体型为Hinc Ⅱ(+)Bam HI(+)与Hinc Ⅱ(-)Bam HI(-)。从而可以推导出

父亲和母亲携带β⁰和携带β^A的染色体的单体型有所不同时，则能相互鉴别，因此再次妊娠时，就可以进行产前基因诊断，否则就不可能。因此用此法的成功率不可能达到100%。
推而广之，只要能获得其他单基因病的基因探针，就可以用同样的原理进行产前诊断。即使不能获得基因探针，只要能找到与该基因紧密连锁的DNA片段，就可以用它作为替代物，来分析该基因旁侧序列中限制酶切位点的多态性，定出其单体型，通过连锁分析，达到产前基因诊断，如前所述的Huntington舞蹈病。可见基因诊断的方法有广阔的前景，将来必定会有越来越多的遗传病可以用这种方法得到产前或临床前诊断。