血痕种属判定

斑痕确定为血痕后，尚须判定该血痕是人血还是动物血，必要时还须判定是何种动物血，即为血痕种属判定。经典的方法是血清沉淀反应。即将某一种属的动物蛋白（抗原）注射于另一种动物体内，该动物血清中便产生对该抗原起特异反应的物质(抗体——沉淀素)。取该免疫血清与所注射抗原同一种属的蛋白溶液在试管内混合时，便产生白色沉淀，是谓血清沉淀反应。此外，目前还应用抗人球蛋白消耗试验、被动红细胞凝集反应、胶乳凝集反应、血红蛋白碱变性等免疫学反应及生物化学检验法判断血痕种属来源。
血清沉淀反应 试验方法有环状沉淀反应、琼脂扩散试验及免疫电渗电泳等。如将抗血清放在小试管底部，稀释的抗原液层积于其上，二液交界面即形成环状白色沉淀，是谓环状沉淀反应。如抗原抗体在琼脂中相向扩散，在二液相遇处形成白色沉淀线，是谓琼脂扩散试验，再结合电泳便是免疫电渗电泳。
环状沉淀反应 或称界面沉淀反应。沉淀反应首先要求制备特异性沉淀素血清。特异性即抗体针对某一特定抗原发生反应的特性。抗体能对某一种属的动物蛋白发生反应而对别的种属不发生反应者，谓之种属特异性抗体。抗体仅能对某一种动物的某一脏器特异蛋白发生反应而对其它蛋白不发生反应者，谓之脏器特异性抗体。特异性是相对的。粗制的抗血清都有非特异性反应。一种是“近亲反应”或“类属反应”，如抗人血清沉淀素血清与猿猴血起反应，抗绵羊血清沉淀素血清与山羊血起反应。这种非特异性反应经稀释抗原可使之减少或消除。另一种是脏器非特异性，如抗人血清沉淀素血清除与人血清蛋白起反应外，还能与人体的多种非血源性蛋白 (如骨胳、肌肉浸液及精液、唾液、汗液、鼻涕等)起反应。检材上如沾有动物血与人体的蛋白（如鼻涕），血痕确证试验阳性，与抗人血清沉淀素血清作沉淀反应，也呈阳性。就可能导致“检材上含人血”的错误结论。特异性抗人血红蛋白沉淀素血清则只与人的血红蛋白起反应，而不与人体其它蛋白起反应，即不仅有种属特异性，还有脏器特异性。其阳性结果可确证为人血。
制备沉淀素血清一般均用家兔免疫。制备抗人血清沉淀素血清时用人血清注射，制备抗人血红蛋白血清时用人的血红蛋白注射。也可制备抗人珠蛋白血清，据认为其不仅有较高脏器特异性，且种属特异性较抗人血红蛋白血清更高(因各种动物的血红素相同，故抗人血红蛋白沉淀素的种属特异性不高。而珠蛋白则各种动物不同)。注射家兔的途径可用静脉注射、腹腔注射、眼结膜下注射等多种方法。注射次数、剂量及间隔时间则视注射途径而异。待免疫血清的效价达到1:20,000以上、与异种动物血的交叉反应在1:1000以下，该免疫血清可认为合格。应从速取该动物血分离血清，防腐备用。粗制的抗人血清沉淀素血清和抗人血红蛋白沉淀素血清，应分别用1/10量的猴血清和猴红细胞吸收，以提高种属特异性。抗人血红蛋白沉淀素血清应用少量人血清吸收，以提高脏器特异性。
检验时先要准备好血痕检材浸出液。一般均将血痕确证试验阳性的检材少许，剪碎后以少量生理盐水浸出，同时取无血痕部位的检材基质进行同样处理作为对照。过于陈旧的检材，可用1～3%的碳酸钠或重碳酸钠或硼酸钠等弱碱液浸出，然后中和备用，如浸出液混浊，应用离心沉淀或过滤或干燥后再溶解的方法使之澄清，否则所得结果就不可靠。还应调整浸出液的蛋白浓度，使之相当于人血清浓度的1/1000～1/10,000。因浸出液中若蛋白含量过高，可发生前区现象(prozone phenomenon)，使抗原抗体相遇时不发生沉淀或形成的沉淀迅速溶解。测定蛋白含量只须用粗略的方法，例如用毛细玻管蘸取浸出液上升约1cm后，擦净管外附着液，再斜插入浓硝酸也上升约1cm时，二液接触面出现薄的云雾状白环即表示浸出液浓度约为血清的1/1000。浸出液中含蛋白量过多者应予稀释。
作环状沉淀反应时，先将沉淀素血清注入沉淀管底部，然后使血痕浸液沿管壁流下，使之层叠于沉淀素血清液之上，两液接触面若出现清晰的乳白色沉淀环即为阳性反应。若反应强烈，最后可全部沉淀于管底。
若反应结果如下表，证明检材含人血。若第1管阳性，而第8管阴性则检材含人的蛋白，不是人血，或者检材过于陈旧，其上的血红蛋白已全部转变为正铁血红素。若表中第2、第9管均阳性，或第7管也阳性，均表示检材中有杂质干扰反应，应浓缩提纯后复试。若除第3、第10管外均阴性，表示检材不含人血。必要时可用抗动物血沉淀素血清鉴别是何种动物血。

环状沉淀反应（以鉴别人血痕为例）

影响沉淀反应的因素主要是：
❶腐败使蛋白变性并分解破坏后，沉淀反应就阴性。分解不甚彻底者仍可呈阳性反应。
❷血痕被水漂洗后，新鲜血痕易被洗去，陈旧血痕则不易洗去。用肥皂水洗血痕，会妨碍沉淀反应。残留在检材上的肥皂，其溶液本身即混浊，与抗血清相遇，混浊度增高。合成洗衣粉对沉淀反应影响更大。洗衣粉即使稀释至1/1000，对免疫血清和正常兔血清均能产生絮状沉淀。用甲醇-乙醇-戊醇-三氯乙烯的等量混合液可将它彻底溶去。试验所用玻璃器皿如用洗衣粉洗刷者，必须用流水漂净，才能避免假阳性。
❸多种化学物质如福尔马林、石灰、石炭酸、醋酸、过氧化氢、高锰酸钾、氯化汞、氯化锡、蛋白酶、鞣酸以及强酸、强碱，均能使蛋白变性而不能溶解，或破坏蛋白的结构或抗原性。
❹低温对血痕无影响，高温则能使蛋白变性。经100℃干热2小时的血痕，沉淀反应尚可阳性，但热至230℃，蛋白就被烧焦，不能发生沉淀反应。故对曾受热（如烫过）的斑痕检材，盐水浸泡时间要长，或用0.1N氢氧化钠浸出，然后用稀盐酸中和。
❺斑痕的陈旧度对沉淀反应可能有一定影响，但一般影响不很大。有时几十年之久的人血痕仍可得阳性结果。
❻血痕如附着在木质或泥土上，其中血清可完全被吸收，只剩红细胞残骸，此时表面血痕必须依靠抗人血红蛋白沉淀素血清才能证明，或须采取血痂底下的木质或泥土，并延长浸泡时间，才能浸出血清成分。还须注意一些木质内含鞣酸，会引起假阳性反应。
微量琼脂扩散试验 在透明胶质（如琼脂）中，抗原与抗体互相扩散相遇时，便形成白色沉淀带。制备时在普通载物玻片上加1ml1%熔融琼脂，凝固后打两组六角形排列的小孔，各组中心各有一小孔。在第一组的中心孔加抗人血清沉淀素血清，第二组的中心孔加抗人血红蛋白沉淀素血清。周围各孔分别加血痕浸液、无血检材基质浸液、已知人血浸液、各种动物血浸液、盐水等。若血痕量少，可在中心孔加血痕浸液(或仅放一小丝血痕，加少许盐水)，周围各孔加各种抗血清(如抗人血清沉淀素血清，抗人血红蛋白沉淀素血清，各种抗动物血清及正常兔血清等)。抗血清效价只需1000～2000，各反应物的浓度应大体一致。在37℃保湿1～2小时，再置室温2～3小时，阳性者在中心孔与周围孔之间出现白色沉淀带。必要时可将沉淀带用胺基黑或偶氮胭脂红(diazo car^m-ine)染色保存。
免疫电渗电泳 或称对流电泳。用离子强度0.1、pH8.6的巴比妥钠-盐酸缓冲液配成1%琼脂。在6×9cm的玻板上加熔融琼脂10ml，冷却后打成多排成对的小孔，阳极孔放抗血清，阴极孔放检材血痕浸液及对照血痕浸液（图）。

免疫电渗电泳示意图

左 抗体血清　右 抗原
抗人　❶检材
㊀抗牛　
❷人血
抗狗　
❸牛血
抗猫　
❹狗血
丨表示沉淀带　
❺猫血
电泳条件为
❶缓冲液为离子强度0.1、pH8.6的巴比妥钠-盐酸缓冲液；
❷电流25～30mA，通电45～60min;
❸抗原端接阴极，抗体端接阳极，在9cm长的琼脂板上电位降为每厘米4～6V。
电泳后，γ球蛋白(抗体，如抗人血清沉淀素血清)移向阴极，而其他蛋白(抗原，如血痕浸出物)移向阳极。两种蛋白相遇时，如为相应的抗原与抗体，就形成白色沉淀带。若检材与抗人的血清呈阳性反应，各阳性对照组均阳性，各阴性对照组均阴性，就可证明检材血痕为人血。
此法可测出稀释度为1/30,000的蛋白。斑痕上有杂质污染也不干扰。
抗人球蛋白消耗试验 检材浸液中的人血清球蛋白与抗人球蛋白血清相遇时，抗人球蛋白被吸附（消耗），再用经球蛋白致敏的红细胞作指示剂，观察消耗后的抗人球蛋白血清对该红细胞的凝集力，如显著下降或消失，即证明检材中含人血清球蛋白。
以人的γ球蛋白免疫家兔，制备抗人球蛋白血清。效价不要很高，因抗体（抗人球蛋白）含量越低，抑制所需的抗原（球蛋白）量便可越少。若用未稀释的高价血清，则当血痕浸液中仅含少量抗原时即不能显示消耗程度。临用时应将抗血清稀释到效价仅为8～16，只需能在直接抗球蛋白试验起反应便可。
制备致敏红细胞，取新鲜O型Rh阳性(OD型)红细胞，用盐水洗涤后作成悬液。此液加稀释的抗D (Rho)血清，经37℃温培。然后用盐水洗涤，配成5%悬液。
试验时将一定量血痕浸液与抗人球蛋白血清混合，置37℃ 30分钟。取1滴混合液与1滴致敏红细胞悬液放载玻片上，观察凝集情况。
同时要以致敏红细胞悬液与下列试剂作对照：
❶生理盐水，应无凝集。
❷其它介质 （牛白蛋白溶液或明胶溶液），可有弱凝集。
❸抗人球蛋白血清，应有强凝集。此外，还要以未经致敏的红细胞的悬液也与上述试剂作用，均呈阴性，本试验才能成立。无血痕处的检材基质也要与检材同样作试验，以排除非特异性消耗现象。
本试验很灵敏，可测出1/50,000的人血清球蛋白。但不便于检验其它动物球蛋白，因其需用各种动物球蛋白致敏红细胞，难以做到。
被动红细胞凝集试验 红细胞经鞣酸处理，便获得结合蛋白的能力。红细胞结合人球蛋白后，再遇抗人球蛋白血清，便发生凝集。据认为此法是种属鉴别试验中最灵敏的。在血痕不溶解于盐水或人血痕混有动物血或检材量极少时，此法更具优越性。
制备致敏红细胞，取兔红细胞用盐水洗涤后配成5%悬液。加等量1/40,000鞣酸盐水溶液，在室温下放20分钟，取此红细胞配成5%悬液。悬液加等量0.07～0.08%人血清(蛋白浓度0.05～0.15g%)，在室温致敏10分钟，然后用0.5～1%兔血清盐水溶液洗涤致敏红细胞1～2次。临用时配成适当浓度。
操作方法有二种： (1)夹层法： 剪取血痕纤维0.2cm，加2滴抗人球蛋白血清，撕开纤维，室温保湿2～3小时。取出纤维，以滤纸吸干，用冷盐水洗涤。然后置纤维于白磁板凹窝内，加3滴5%致敏鞣酸化兔红细胞悬液，室温放半小时。取出纤维，小心在盐水中洗涤后，显微镜检查，有红细胞附着在纤维周围为阳性。
(2) 解离法： 取血痕纤维1cm，吸收抗人球蛋白血清后用冷盐水小心洗涤。吸干后将纤维放试管内，加2滴盐水，置56℃ 10分钟，使抗体解离。迅速加入一滴0.2%致敏鞣酸化兔红细胞，离心(1000转/分)1分钟，镜检有凝集反应者阳性。在操作过程中，温度需保持于20℃内。此法还可检查脏器组织碎片、小便、毛发及指甲的种属来源。
此外，还可将鞣酸化人O型Rh阴性红细胞先与血痕浸液作用，再观察它与抗人血清沉淀素血清或抗人球蛋白血清能否凝集。能凝集表示血痕中含人血。也可用人血清致敏的鞣酸化绵羊红细胞作指示剂，测定经血痕吸收的抗人血清沉淀素血清是否还能凝集指示红细胞。若凝集力消失，可证明血痕中含人血。
胶乳颗粒凝集试验 胶乳颗粒能吸收蛋白。利用它作抗球蛋白抗体的载体，当与含有相应种属的血痕浸液相遇时，便发生凝集反应。
常用的胶乳为聚苯乙烯(polystyrene latex)颗粒，直径0.81～1.17μm，或聚乙烯甲苯 (polyvinyl toluenelatex)颗粒，直径0.77～0.98μm。以硼酸盐缓冲液浸泡备用。
试验时取1%胶乳悬液加抗血清使胶乳致敏，然后与血痕浸液作用。同时以检材旁无血痕部位对照。如血痕浸液与胶乳凝集，对照检材无凝集，表示该血痕为人血。两者均阳性，为非特异凝集（可能胶乳自凝），应重复试验。两者均不凝集，表示不是人血。胶乳颗粒也可吸附抗原，与相应抗体相遇时也发生凝集。
本法能测知的蛋白浓度约为1μg/ml。本法有一定程度的种属交叉反应。
纤维蛋白板法 人类血清较其它动物血清含有更大量激活质原，激活质原在链激酶存在下变成为激活质，它能使纤维蛋白溶酶原变为纤维蛋白溶酶(plasmin)，后者可使纤维蛋白降解。
制备纤维蛋白板可在有凹窝的玻板上。每窝滴加牛纤维蛋白原溶液3滴，再各加凝血酶液1滴，混匀后静置数秒钟即凝成白色的纤维蛋白板，在37℃放至表面干燥即可用。
试验时剪取检材少许放纤维素板中央，滴加新鲜配制的链激酶 (10～20u/ml，过浓时反应特异性就降低)1滴。保湿放置37℃，每半小时观察一次，共2～3小时。同时还应以空白检材，已知人血及若干家常动物血作对照。凡检材周围纤维蛋白被溶解者为阳性。若血痕检材和已知人血痕阳性，其余检材阴性，表示该血痕为人血痕。若只有已知人血痕阳性，其余均阴性，则表示该血痕不含人血，或血痕太陈旧，激活质原被破坏或检材含血量太少。人血稀释10倍，在2小时内呈阳性，稀释20～50倍，3小时可呈阳性。月经血不加链激酶就能使纤维蛋白溶解。
血红蛋白碱变性试验 加碱于血红蛋白溶液，可使血红蛋白变为碱性正铁血红素。人血红蛋白的变性速度远较家常动物(猫、狗、鸡、山羊、绵羊、牛)为快。1～3个月的血痕的蒸馏水浸出液，变性速度与新鲜血液一样。人血7～12分钟，猴血12分钟，猪血60分钟，狗血120分钟，其它家常动物均在24小时以上。作碱变性试验时，血红蛋白稀释度不能超过1/950，否则不能见到碱变性。胎儿血及新生儿血中所含胎儿血红蛋白(HbF)对碱变性有很大抵抗力，其变性时间与动物血很难区别。
对于现场所见很新鲜甚至尚未干燥的血痕，也可作血涂片检查红细胞形态，便可识别是否人血。或者取未凝固的血迹中的红细胞与AB型的人血清作用，如不发生凝集，表示是人血。因为人血中含有异种红细胞凝集素，能与动物血凝集，AB型血清不含抗A及抗B凝集素，与各型人血均不凝集，只能与动物血凝集。
上述各种判定血痕种属的方法中，最常用的还是环状沉淀反应。因为它简便易行，不要求复杂的仪器设备，反应较稳定，结果易判断。但其缺点是所需检材较多，而且在有杂质干扰或有几种动物血混在一起时难以作出明确结论。在这种情况下，就要考虑采用微量琼脂扩散或对流电泳法。至于被动血凝试验、抗人球蛋白消耗试验，虽都很灵敏，但操作技术复杂费时，不易普遍推广。胶乳凝集反应方法简便，在现场即可施行，但非特异性较高。纤维素板法也较复杂，用得不多。