血清学诊断技术serological diagnosis techniques

用含有特异性抗体的血清与相应抗原进行特异性结合反应的技术。如沉淀反应、凝集反应、酶联免疫吸附、免疫电镜、免疫荧光等技术。用已知抗体可以测定未知抗原病毒，也可用已知病毒抗原检测未知抗体，以此对未知抗原、抗体进行诊断、鉴定，研究抗原抗体性质等。
抗原 凡能刺激动物机体产生免疫反应的物质称为抗原。蛋白质、糖蛋白、脂蛋白和多糖都是良好的抗原，双链核酸也具有抗原性。蛋白质的抗原性与其分子量、氨基酸组成、分子形状有关。分子量达到10 000以上才有较好的抗原性，植物病毒蛋白分子量都大于1 000 000，所以都具有很好的抗原性。蛋白质组成中芳香族氨基酸起着重要作用，酪氨酸含量高的蛋白质抗原性强。抗原特异性是由分子表面的一些特殊基团（决定簇）所决定的。蛋白质表面存在着许多决定簇，每一个决定簇一般由2～6个氨基酸组成，分子内部也存在着许多决定簇，经化学和物理方法处理后可暴露出来。蛋白质分子的形状对抗原性也有很大影响，一般球状分子比长形分子的抗原性强； 蛋白质聚合状态比单体状态的免疫原性强，如病毒粒子比蛋白质亚基的抗原性强。
抗体 动物的B淋巴细胞经抗原刺激后合成的免疫球蛋白，以“Ig”表示。根据理化性质和免疫学性质不同，至少可分为五种免疫球蛋白，即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，但各类动物并非都能产生这5种Ig，如家兔产生IgG、IgM、IgA三种； 马产生IgG₁、IgG₂、IgA、IgM; 两栖类产生IgG、IgM; 鱼类只产生IgM。家兔注射抗原后，血液中最早出现IgM，然后出现IgG，最后出现IgA，其比例以IgG最多，IgA、IgM次之。在血清学诊断中起主要作用 的是IgG。免疫球蛋白基本结构相似，都是由四条多肽链组成，其中两条相同的长链称为重链(H链)，两条相同的短链称为轻链(L链)，两条重链借二硫键连接起来，两条轻链又借二硫键分别连接在两条重链的两侧，整个免疫球蛋白分子结构是对称的Y形（见图）。

免疫球蛋白(Ig)模式图

抗血清 动物经抗原物质刺激后产生的含有相应抗体的血清。一般将带病组织处理后获得纯化的病毒抗原，直接静脉注射，或与佐剂乳化后经皮下、皮内、腹腔等途经注射家兔、鼠、羊、马等动物，然后经耳静脉、颈动脉、心脏等途径采血，离心去除血细胞获得特异抗血清。
蛋黄抗体 病毒抗原注射母鸡后，所产蛋的蛋黄中含有特异的免疫球蛋白Y(IgY)，这是用于诊断的鸡体内主要的免疫球蛋白。用聚乙二醇(PEG)分离法提取蛋黄中的IgY，即蛋黄抗体。
单克隆抗体 人工培养的鼠骨髓瘤细胞与免疫的小白鼠脾细胞融合，获得能产生针对单一抗原决定簇的抗体。这种杂交瘤细胞能像骨髓瘤细胞那样培养生长，因而可以无限制地产生均一的抗体。
抗原抗体反应 抗原与相应抗体的特异性结合，形成可逆性的抗原抗体复合物。抗原抗体反应需要抗体、抗原和电解质的存在，其反应可以分为两个阶段。第一阶段是特异性抗体与抗原结合，使亲水系统变为憎水系统； 第二阶段是特异的，由于电解质的存在，使电势下降，因而引起可见的凝集或沉淀反应。抗原抗体的结合是分子表面的结合，抗原抗体本身都未受破坏，是相当稳定的。但是这种反应又是可逆的，在一定条件下，如经盐水稀释或蛋白酶处理后可解离，将抗原抗体释放出来，其性质并不改变，作为抗原的病毒仍具有侵染性，抗体仍能沉淀相应的病毒抗原。按上述原理进行的各类血清学试验，广泛地应用于植物病毒的诊断鉴定，包括沉淀反应、凝集反应、酶联免疫吸附反应、免疫电镜技术、放射免疫测定等。
沉淀反应 将可溶性抗原与相应的抗体混合，当两者比例合适，并有盐类存在时，即有沉淀物出现，称沉淀反应。此反应如果在半固体琼脂中进行，可出现沉淀线，据此原理建立的方法很多，应用亦很广泛。
试管沉淀反应 在小试管中，加人生理盐水作适当稀释的抗原和抗体各0.5毫升，充分混合后，在37℃水浴中静置2小时，观察沉淀反应的结果。
环状界面沉淀试验 在内径为2.5毫米小试管中加入0.1～0.2毫升抗血清，再取等量不同稀释度的抗原，沿管壁徐徐加入，使之重叠于抗血清之上，室温静置数分钟，在抗原抗体接触面形成白色沉淀环时可诊断为相应病毒。
微量沉淀反应 在铺有聚乙烯缩甲醛疏水薄膜的平皿底上滴一滴约7微升抗血清，然后加入等量澄清病毒抗原液，轻轻摇动，再缓缓加入石蜡油，使之覆盖所有液滴表面，3～6小时后肉眼、放大镜或解剖镜观察沉淀反应结果。
毛细管沉淀反应 在内径1.0～1.2毫米毛细管中分别吸取抗血清和等量抗原液各1厘米高，再将毛细管反转多次，使抗原抗体充分混匀，数分钟后，相应的抗血清与抗原发生沉淀反应。
琼脂免疫扩散试验 可溶性抗原与抗体，在含电解质的半固态琼脂凝胶内自由扩散，抗原抗体在适宜比例处相遇后产生沉淀反应复合物。目前常使用的是玻片琼脂免疫双扩散法检测病毒。即抗血清和抗原同时分别加入玻片上琼脂凝胶的两个相对孔中，两者互相扩散，形成抗原抗体反应沉淀线。根据沉淀线的特征，比较相邻孔中抗原成分，诊断鉴定病毒。
琼脂免疫电泳 电泳和琼脂免疫扩散反应相结合的方法。病毒抗原加入琼脂凝胶孔中，电泳使其组分在电场中分开，然后在琼脂板上与电泳方向平行的长槽内加入抗血清，使其与分散的抗原组分互相扩散而产生沉淀反应，不同抗原的组分分别与相应抗体形成沉淀线。可用于分析、鉴定病毒。
对流免疫电泳 病毒的抗原蛋白是一种两性电解质，在碱性溶液中带负电荷，在电场中泳向正极。抗体是分子量较大的免疫球蛋白，在碱性溶液中所带电荷甚少，由于琼脂的电渗作用使其向负极泳动，这样抗原、抗体在相对泳动中相遇而起反应。此法比免疫双扩散和免疫电泳的灵敏度略高。方法是在琼脂平板上，按一定距离打两排孔，将待测抗原滴加于阴极端小孔中，抗血清滴加于阳极端小孔中，通电后抗原、抗体向相对方向泳动，相应的抗原、抗体形成沉淀线，根据沉淀线的形成和沉淀线的形状诊断病毒。
凝集反应 颗粒性抗原悬液中，与含有特异抗体的血清，在电解质存在情况下，产生可见的凝集反应。感染病毒的病组织榨汁中，病毒往往吸附在叶绿体表面，可与抗体结合。这种抗原抗体结合出现凝集现象称直接凝集反应，如玻片凝集试验等。如果把抗体吸附于一种与免疫无关的颗粒表面，然后与相应抗原结合而出现的凝集反应称间接凝集反应。用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、碳粒、红细胞、A蛋白等。
玻片凝集反应 在洁净的载玻片上滴2滴适宜浓度的抗血清，再加入一滴待检抗原汁液，混匀后，室温静置20～50分钟观察凝集现象，这是40年代就用于诊断病毒的血清学技术。灵敏度较低，属于毫克水平的诊断方法。
皂土凝集反应 特异抗体吸附在经处理的皂土颗粒表面，制备出致敏的皂土悬液，取0.05毫升皂土悬液与0.1毫升待测病叶澄清液置玻片上，微震荡混匀后产生凝集反应，用肉眼或解剖镜观察结果。同样，可以将抗体吸附到乳胶活性炭等颗粒表面，制备致敏的乳胶或活性炭等。这种间接凝集试验的灵敏度比直接凝集反应高100倍，属于微克水平的诊断方法。
A蛋白乳胶凝集反应 A蛋白与乳胶结合再与抗体球蛋白结合成乳胶—A蛋白—抗体偶联物，取0.025毫升这种偶联物与0.05毫升待测抗原液滴在载玻片上，震荡后即可见到抗原抗体反应的凝集块。可较灵敏地检测病毒抗原。
反向间接血球凝集反应 抗体球蛋白经胃蛋白酶水解处理获得F(ab)₂碎片，与经鞣酸处理的红血球细胞结合制备出致敏红血球，再与等量待测抗原同时滴在血凝反应孔内，混匀后出现颗粒状的凝集反应，此法曾应用于水稻普通矮缩病毒的病植株和带毒昆虫的诊断和检测。
酶联免疫吸附试验 通过化学的方法将酶与抗体结合，然后与相应的抗原反应，形成含有酶的抗体抗原复合物。酶在遇到相应的底物时，使无色的底物产生水解、氧化或还原反应，生成有色产物，通过颜色定性、定量诊断病毒。酶联免疫吸附试验的灵敏度比沉淀反应高数千至一万倍，可达毫微克水平，具有快速、灵敏、简便、安全的优点，是目前应用最广泛的血清学诊断技术之一。用于诊断植物病毒的酶联免疫吸附方法主要有以下几种。
直接酶联法 用酶标记特异抗体球蛋白直接检出样品中的抗原。将待测抗原包被酶联反应板，孵育、洗涤，随后加特异酶标记抗体，使抗原和酶标记抗体反应，再加酶的底物，即产生颜色反应，通过酶标仪测定光密度值，诊断病毒抗原。
双抗体夹心酶联法 即用酶标记抗体诊断检测相应病毒抗原的方法。检测时首先把适宜浓度的特异抗体包被酶联板，孵育、洗涤，加入待检样品，同上处理后加入酶标记抗体、底物溶液，经酶标仪测定光密度值，诊断病毒。
间接酶联法 制备家兔免疫球蛋白的山羊抗体，并与酶结合成酶标记抗体，然后只要把欲测病毒制成兔抗血清，即可进行酶联测定。做法是把待测病毒抗原包被酶联板，加入特异兔抗血清，再加入羊抗兔酶标记物，最后加入底物溶液，观测结果。
A蛋白酶联法 这是间接酶联法的一种，即利用A蛋白(金黄色葡萄球菌壁提取的纯蛋白A)与免疫球蛋白G (IgG)的Fc片段特异结合，但不影响IgG与相应抗原结合的特性设计的一种酶联法，此法只要将病毒免疫家兔（或鼠）制备特异抗血清，用A蛋白及其A蛋白酶标记物，即可组合酶联试验。实验程序为： 适宜浓度的A蛋白包被酶联板，孵育、洗涤，然后同上法依次加入特异抗血清、待测标样、特异抗血清、A蛋白酶标记物、底物，显色、观测结果。
免疫电镜 免疫学与电子显微镜技术相结合的病毒诊断技术，即在电镜用的铜网上滴一滴抗血清，10分钟后滤纸吸干，冲洗后加一滴抗原，同上步骤处理后再滴抗血清，经2%醋酸双氧铀染色，电镜下可观察到由于抗原、抗体结合诱捕到的病毒粒子，并且粒子周围均匀地包上一层抗体球蛋白形成的外套，这是诊断植物病毒的一种快速、灵敏、直观的方法。
放射免疫测定法 用同位素标记技术与免疫学技术相结合的一种测定方法，它是利用被放射性标记的抗原和未被标记的同种抗原在同一体系中与相应抗体进行竞争反应，在反应体系中，由于标准抗原的浓度是已知的，待测的未标记抗原量就可以根据标记抗原与抗体结合时所受抑制程度，推测出标记的抗原量。此法检出病毒抗原的灵敏度可达毫微克至微微克。
免疫荧光技术 荧光色素与抗体球蛋白结合成荧光素标记物。带荧光的抗体仍可以特异地结合相应抗原，利用荧光显微镜，在紫外线照射下，可以观察到带荧光的反应产物。用于诊断植物病毒的荧光抗体技术有直接法、间接法。直接法是将荧光抗体溶液直接滴于抗原标本上。间接法，首先必须制备荧光素标记抗免疫球蛋白的抗体（抗抗体），实验时将未标记的特异抗血清与抗原结合，然后再加上荧光抗抗体，在荧光显微镜下观察到的荧光即为荧光抗抗体—抗体—抗原复合物。此法适用于研究组织细胞内的抗原定位和病原诊断、鉴定。