脂类分离及检测原则

脂类提取 生物体内的脂类多以疏水键、氢键及Vander Waals （范德华）力等与蛋白质或糖类相结合，要提取脂类，必须应用极性溶剂先破坏这种结合。但是，生物体内存在大量水分，提取脂类所使用的有机溶剂，又必须是极性弱的溶剂；为使水和非极性溶剂相互混合，则有必要同时加入极性溶剂。提取脂类的合理溶剂，一般包括极性溶剂和非极性溶剂。以前曾用Bloor的醇-醚溶剂系，现在则多用Folch和Bligh_Dyer的氯仿-甲醇系，脂类在不同有机溶剂中的溶解度有一定差别，因此，应根据组织及其含水量的不同，参照提取的需要，选择适当的溶剂系统(表1)、溶剂比例和用量。提取脂类时的温度多为25～35℃。
脂类粗提取物通常都含有水溶性非脂成分(如氨基酸、糖、多肽及无机盐等)，在进行脂类的分离、精制或鉴定分析之前，必须将其除去。清除的常用方法有：
❶Folch洗净法，即利用许多非脂性杂质较易溶于盐溶液，不易溶于有机溶剂的性质而将杂质除去；
❷运用二元共沸混合物法，除去少量水分或溶剂；
❸交联葡聚糖柱层析法。

表1 一些脂类的溶解特性

脂 类	有机溶剂
	乙醇	丙酮	乙醚	吡啶
磷脂酰胆碱（卵磷脂） 磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）	(+) (+)		+ +
鞘磷脂	(+)			(+)
脑苷脂	(+)	(+)		+
油 脂	+	+	+
胆固醇	+	+	+	(+)

注 +: 可溶；-: 不溶；(+): 加热可溶

表2 脂类薄层层析的检出试剂和方法

脂 类	试 剂	检出法
一般脂类	50%H2SO4	喷雾后，160～250℃加 热20～30min(棕→黑 色)
	重铬酸钾1.2g+55%H2 SO4200ml	180℃加热30～60min (棕→黑色)
	0.05%若丹明B—95% 乙醇液	紫外光下可检出（荧光）
	0.05%若丹明6G水溶 液或	紫外光下可检出（荧光）
	0.03%若丹明6G— 95%乙醇液
	0.2%2’-7’-二氯荧光 素乙醇液	紫外光下可检出（荧光）
	5～10%磷钼酸-乙醇 液	100～120℃加热10mim （黄地显蓝色）
不饱和脂类	用碘蒸气熏板，或2% 碘-乙醇液喷雾，0.2%	（棕褐色）
	二苯卡巴腙-乙醇液	（紫色）
酯型脂类	羟胺液	用FeCl3-HCl 液处理（紫色）
磷脂类	钼蓝试剂	（蓝色）
	0.1%溴麝香草酚蓝-10 %乙醇液(NH4OH碱性)	（黄地显蓝色）
磷脂、糖脂	钼酸铵-过氯酸试剂	80℃加热10min（蓝色）
糖 脂	二苯胺试剂 0.2%α-萘酚-50%甲醇 液	105℃加热20min（灰色） 风干后，95%H2SO4喷 雾，120℃加热（蓝紫色）
	0.5%过碘酸液	放置2～3min后，1%联 苯胺-乙醇液喷雾(蓝地 显白色)
神经节苷脂	间苯二酚溶液	以玻板覆盖，150℃加热 8～12min（红紫色）
含氨基的脂类	0.2～0.3%茚三酮-丁 醇液(或丙酮、乙醇液)	105℃，加热5min （红紫色）
含胆碱的脂类	Dragendorff试剂*	（黄地显红棕色）
醛、酮、链烯 醚型磷脂类	0.5%2,4二硝基苯肼— 2MHCl	(黄、红黄色)
固醇，固醇酯	0.5%三氯化锑-氯仿 （醋酸）液，三氯化铁溶 液	100～110℃加热10min, 紫外光下检出，100℃加 热3min（红紫色）

表2 注： ^*碱性硝酸铋1.7g溶于20%醋酸100ml(A液)。
B液： KI40g溶于100ml蒸馏水中。A液： 20ml,B液5ml，加蒸馏水70ml混合之。
活体组织常含有各种高度不饱和脂肪酸，与空气接触容易被氧化，故在提取、分离过程中有可能发生富含不饱和脂肪酸的脂类结构和生物学性质的改变。所以，提取脂类须注意下列几点：
❶样品要新鲜，尽快提取；
❷有机溶剂，纯度要高，必要时可向溶剂中加入抗氧化剂，最常用的如2,6-二-t-丁基-p-甲酚(2,6-di-t-butyl-p-cresol,BHT)，但是BHT在气相层析中出现近似豆蔻酸甲酯的波峰，在分析之前需要除去；
❸避免自然光线的照射；
❹处理脂类及驱除溶剂时，易发生氧化反应，应特别注意。驱除大量溶剂时，可用旋转蒸发器，在40℃以下减压浓缩，并在氮气流下恢复常压；
❺脂类的保存，如以液态储藏，可用非（或弱）极性溶剂如氯仿、苯及醚等溶解，后二者并加氯仿作稳定剂，在充氮容器中-15℃以下保存。值得注意的是乙醇在极性溶剂中，易引起磷脂中酯键的转位反应，故避免使用。
脂类的分离、精制和鉴定 薄层层析和气-液相层析法是目前分离、精制和鉴定脂类的主要方法。
薄层层析 薄层层析最大特点是灵敏度高、分辨力强且操作简便迅速。固定相常用硅胶、氧化铝、硅藻土和DEAE-纤维素等惰性物质，流动相则选用各种有机溶剂。分离机理极可能是吸附和分配过程的协同作用。根据分离组分的不同，一方面可以改变流动相的极性，进行双向展开或分次展开； 另一方面又可在吸附剂或分配剂中加入硝酸银、硼酸等以提高脂类的分离效果。薄层展开后，对不带颜色的物质可选择适当试剂显色，并以Rf值表示物质在薄层上的位置。脂类薄层层析的检出试剂和方法见表2。为了鉴定待测样品中的某一成分，可用标准样品进行对照； 若将显色的斑点刮下，再以适当溶剂洗脱则又可进行定量测定，但必须做展层空白。
一般认为己烷：二乙基乙醚：甲酸溶剂系对固醇、固醇酯、三脂酰甘油、二脂酰甘油、一脂酰甘油、磷脂和非酯化脂肪酸等的分离较好；氯仿：甲醇：乙酸：水的溶剂系有利于磷脂类的分离(图1,2)。

图1 主要脂类的薄层层析

溶剂系己烷： 二乙基乙醚： 甲酸(80:20:2V/V/V)

图2 血清磷脂的薄层层析

溶剂系氯仿：甲醇：乙酸：水(50:25:7:3V/V/V/V)

非酯化脂肪酸亦可用薄层层析法进行分离，但必须先甲酯化，或先在板上添加硝酸银等试剂。薄层层析不但可以应用于一般脂类的分离、鉴定，而且可用于脂酶系反应产物和反应速度的检测。
柱层析 柱层析包括吸附、分配及离子交换层析等。其用途如表3所列。

表3 柱层析的种类和用途

上柱后的样品可用适当溶剂或溶剂系展开，由于所用固定相种类不同，检样成分因吸附力、分配系数、电荷或分子量的差别而逐渐分离。洗脱剂的极性可逐渐增加或按梯度增加，这样可从吸附力较弱的脂类逐步洗脱，分别进行分析。
硅酸广泛应用于单纯脂类及复合脂类的相互分离； 糖脂除去磷脂、糖脂的相互分离常用活性硅酸镁；精制含胆碱的脂类时常用氧化铝。尽管柱层析对脂类化合物粗分为几类是有效的，但各种纯脂类的进一步分离和定量测定则需要配合其他方法。
气-液层析 气-液层析是以样品组分在液-气两相之间进行分配为基础的。它具有快速、灵敏、样品用量少及层析柱可反复使用等优点。先将包被有非挥发性、高沸点的液体固定相（如硅酮油）的惰性颗粒支持物 （如硅胶或耐火粉）装在层析柱中，再使气化了的样品随一定流速的惰性气体通过层析柱。由于气化样品的各组分在液-气两相之间的分配系数不同而分离。分离了的组分由惰性气体(载体，如氦气、氩气等) 带入鉴定器，经过放大在自动记录仪上描出气-液层柱图谱，并根据峰面积计算其浓度。用气-液层分析脂肪酸混合物是十分成功的，它不仅可以用来分离含有不同碳原子的脂肪酸，而且也能分离饱和度不同或分枝不同的脂肪酸。分离时通常是先将脂肪酸甲酯化，但有时也可以直接用脂肪酸进行层析。

表4 用DEAE-纤维素柱层析分离脂类^*

洗脱剂	洗脱的脂类
1.氯仿600ml 2.氯仿-甲醇(9∶1)675ml	中性脂类、BHT 磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰 胆碱、鞘磷脂
3.氯仿-甲醇(7∶3)+0.02% 醋酸675ml	脂肪酸、磷脂酰乙醇胺
4.甲醇750ml 5.氯仿-醋酸(3∶1)750ml 6.醋酸750ml 7.甲醇300ml 8.含有50mmol醋酸铵的氯仿- 甲醇(4∶1)溶液750ml+28% 氨水15ml	盐（来自酸性磷脂） 色 素 磷脂酰丝氨酸、色素 醋 酸 磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷 脂酰甘油、双磷脂酰甘 油

*试样为100～300μg的氯仿溶液
应用各种物理学方法进行有机化合物（包括脂类）的鉴定和结构的分析，已远远超出了化学方法，通常后者只作为前者的补充工具。目前红外吸收光谱、紫外吸收光谱、核磁共振谱和质谱等均已用于脂类的检测。其中红外吸收光谱，由于能对各种官能团给出特征性的吸收带，且仪器小型、操作简便而被广泛应用。
血脂分析 血脂包括：
❶三脂酰甘油及少量二脂酰甘油和一脂酰甘油；
❷磷脂，主要是磷脂酰胆碱，此外尚有溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂等；
❸胆固醇和胆固醇酯；
❹非脂化脂肪酸。脂类难溶于水，血浆中脂类是以脂蛋白的形式存在和运输的。血浆脂蛋白主要由蛋白质（载脂蛋白）和甘油三酯、胆固醇及其酯、磷脂和少量糖脂等组成，是一组密度、电泳迁移率、免疫化学性质及生理功能不同的极不均一的复合物。血脂的分析，包括高密度脂蛋白-胆固醇的检测，对冠心病、动脉粥样硬化症的诊断、治疗及预防有重要意义。此外，还有助于糖尿病、肾病、胆道梗阻和内分泌紊乱所致的代谢障碍性疾病的诊断。
血脂分析的方法大体可分为三方面：
❶脂蛋白的分析，有超速离心法、电泳法及沉淀法或比浊法等；
❷脂蛋白分子中蛋白质部分的分析法，一般较常用的是观察其抗原性的免疫法；
❸分析脂蛋白分子中的脂类成分，主要用化学和物理的方法。除一般比色法外，用于分析不同脂类各成分的方法有薄层层析法、酶学法及电泳酶学法等。脂肪酸组分的分析常应用气-液层析法。

图3 三种分离脂蛋白方法的比较

脂蛋白的分析 (1)超速离心法： 超速离心法是血清（浆）脂蛋白分类的依据之一，也是分离、提纯和鉴别高分子物质的重要技术。一般用氯化钠、溴化钠、溴化钾、氯化铯及蔗糖等水溶液为溶剂。常采用的是NaCl-H2O系(为防止脂类的氧化，内含10^-3～10-⁴molEDTA-Na₂)。
各类脂蛋白的蛋白质和脂类含量不同，密度各异，因而就有不同的沉降或漂浮速率。根据血浆脂蛋白的上浮率(Sf)，一般将它们分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白 (VLDL)、低密度脂蛋白 (LDL)及高密度脂蛋白(HDL)四大类，各类中又可以分为若干亚类。一个Sf是指脂蛋白在密度为1.063的盐溶液中，26℃时上浮率为10-13cm/s/dyn/g。脂蛋白含脂类成分越多、蛋白质成分越少，其密度越小，Sf值越大。
超速离心分离后的脂蛋白可以进行电泳，脂类提取、脂类定量和蛋白质定量等项分析，但高浓度的盐类存在可以干扰测定，必须先经透析除去。超速离心、聚丙烯酰胺和纸上电泳分离脂蛋白以及其分子量大小、密度的关系，如图3。
(2) 电泳法：脂蛋白电泳法与其他蛋白质电泳一样，可用滤纸、醋酸纤维素、淀粉胶、琼脂、琼脂糖胶和聚丙烯酰胺类作支持物。但是，脂蛋白电泳时必须使用较低浓度的琼脂糖胶、聚丙烯酰胺等凝胶，而琼脂对LDL和VLDL的分离不够满意，不宜采用。另外，用加入适量清蛋白的巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.1)分离效果良好，尤其对VLDL的分离。
各类脂蛋白的载脂蛋白不同，所带净电荷量和颗粒大小亦不相同，故在一定的电场强度下，其电泳迁移率不同。但用不同支持物进行电泳时，同一脂蛋白的电泳迁移率也不尽相同(表6)。
(3) 沉淀法：多价阳离子沉淀法是常用的沉淀法之一。VLDL和LDL因含有带正电荷较多的赖氨酸和精氨酸残基的载脂蛋白，可与多价阳离子的硫酸多糖类 (如硫酸葡聚糖、肝素、硫酸支链淀粉等)形成不溶性复合物。2价金属离子(Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺及Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺等)、pH和离子强度是不溶性复合物形成的重要因素。一般生成沉淀的pH为6.5～8.5。复合物的溶解度易受脂蛋白与多价阴离子之间相对浓度的影响，故需避免多价阴离子的过剩和脂蛋白浓度的过高。在上述条件下形成的不溶性复合物沉淀，其浊度在一定范围内与VDL及VLDL的含量成正比。此沉淀物相当于超速离心法Sf0～400的脂蛋白。这种沉淀物能溶于含Na2-EDTA的5～10%氯化钠溶液(pH7.0)，因此可以利用这一性质来纯化脂蛋白。

表6 血浆脂蛋白的泳动位置(pH8.6)

支持物	移动位置→(+)*
	γ- 球蛋白	原点	拖尾	β	Pre-β	α2	α1	清蛋白
滤 纸 聚丙烯酰	Ig	CM	(VL DL)	LDL	VLDL	HDL		清蛋白
胺凝胶(5 ～3.7%)	Ig	CM	VLDL	LDL	HDL			清蛋白
琼脂糖 (1～2%)	Ig	CM	——	LDL	VLDL		HDL	清蛋白
淀 粉	Ig	CM	——		——	VLDL	HDL	清蛋白

*(+)为阳极
近年来有人利用磷钨酸钠-镁沉淀VDL-VLDL的方法分离血清，并测定上清液中高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的含量。
三脂酰甘油测定 用异丙醇、氯仿-甲醇或醇醚混合液等有机溶剂提取，并以固相吸附剂（如硅酸等）除去磷脂及其他杂质(糖，胆红素等)，再经皂化，即可测定三脂酰甘油中甘油的含量。甘油的测定有比色法、荧光法和层析法等，在我国目前广泛应用的常是比色法。即将甘油氧化成甲醛，再用变色酸或乙酰丙酮显色，就可以进行比色测定。
用正庚烷-异丙醇混合溶液提取三脂酰甘油，再进行酶学法测定，则不需除去磷脂即可直接进行测定。三脂酰甘油的酶学测定法有多种现将其中的一种例举如下：
最后用340nm波长测定NADH的生成量，即可了解三脂酰甘油的含量。
胆固醇测定 血浆胆固醇包括游离型和酯型两类，而且都以脂蛋白的形式存在。
血浆胆固醇的测定首先需要分离两型胆固醇，然后再分别进行测定。分离方法有：
❶洋地黄皂苷沉淀法；洋地黄皂苷能使游离胆固醇沉淀。本法在我国最常应用；
❷氧化铝薄层层析法；
❸分别提取法，游离型可溶于醇：水(1:0.55体积比)混合溶液，酯型不溶于醇：水混合溶液而溶于醇酮混合溶液。
测定胆固醇的方法很多，如重量分析法，比浊法，层析法，荧光法，酶学法及比色法等。目前国内应用最广的是比色法。经溶剂提取的或不经溶剂提取的胆固醇均可进行显色。但后者易受胆红素等杂质的干扰。临床检验中常用的显色法有用强酸试剂（浓硫酸或醋酸酐）或高铁硫酸两类。
酶学法的基本原理是胆固醇酯可以被胆固醇酯酶水解，生成游离胆固醇，后者再受胆固醇氧化酶作用，定量的产生△4-胆固烯酮和过氧化氢。过氧化氢既可用氧电极法直接测定，又可以在过氧化物酶催化下使4-氨基安替比林显色，或先与甲醇反应使之产生甲醛，再以乙酰丙酮及氨显色，并比色测定之。