相差显微镜术

相差显微镜用于未染色标本的观察，其原理是利用二个光波的相位差可互相干扰其振幅的大小，从而出现光线强弱和反差的效果而成可见之影像。如两个振幅和波长均相同的光线，可因振动相位不同，而在其相互重合干扰后产生大小不同的振幅。如两波峰相符合（同一相位），则产生倍增振幅，光线即增强。而相反相位时，则互相抵消，振幅为零而无光。所以说频率相同的多束光线，在同相位时增强振幅使光线增强；在相反相位时，则互相抵消，光线减弱。但当相位差少于半个波长时，则振幅干扰的差别不明显，因而光线强弱的变化也不明显。
亮视野映光法中，未染色的切片之所以看不见其镜下内容，是由于所通过的光线相位变化的差别很小之故。染色物质的可见则是由振幅差及波长吸收（光谱吸收）的改变影响了颜色的反差而得到的。相差显微镜的原理，就是利用一个相位板加在接物镜上，使通过组织切片的部分光线减慢1/4波长距离，因而获得相位后移，能使本来看不到的微小相位差变成可见影像的相位差(半个波长，振幅差别显著)。台下相差聚光镜上，必须装有一个环形过光片，以使通过的光线成为一个圈形聚焦光束。并在其焦点距离处通过标本然后进入接物镜。在物镜中，再通过一个在玻片上加用特定折射率材料制成的圈形相位板。此相位环能使通过标本后的成影部分光束的光波拖慢1/4波相位。此拖慢相位光部分又与通过相位板上非相位环部分的成像之正相光部分相结合，并发生干扰而产生光线的明暗变化和反差，成为可见像。这样的过程也可称作光学染色。在医学和生物学的研究工作中，主要用于对不能染色的活体组织或细胞的观察，在组织培养技术中用途较广。在使用相差显微镜时，须注意调整台下聚光镜环之中心，使它与物镜中的相位环相重合，才能产生相差效果。这种调整可用一望远测焦目镜置于接目镜位置上观察，就可同时看见聚光镜环及相位环，再调整台下聚光镜的中心使上下二环相重叠而完成。

图1 相差显微镜的结构原理

图2 聚光镜环的调整