电子显微镜生物标本制备术

由于电子显微镜的问世和超薄切片技术的发展，30多年来人们对于生物组织和机体的显微解剖有了新的认识。超薄切片、冷冻蚀刻和扫描电镜标本制备技术所显示的亚细胞结构，已成为或正在充实现代细胞学、组织学和病理学的基本内容。在病理学领域内，亚细胞水平以至分子水平的科学研究成果对病理学基本理论的发展起了很大推动作用。
超薄切片技术 透射电子显微镜成像需要有足够数量的电子穿透标本。但是电子的穿透能力比较弱，如用50kV加速电压的电子射线观察密度为1，厚度为100nm的标本时，只有50%的射线能透过标本，所以电镜观察用的切片要求厚度在100nm以下。一般为50nm或更薄一些，即所谓的超薄切片，其制备的基本步骤是：
❶固定： 杀死细胞，同时保存组织和细胞的亚细胞结构。
❷脱水： 用逐级乙醇或丙酮等既溶于水又溶于包埋剂的试剂将组织内部的水分脱尽。
❸浸透与包埋： 用包埋液逐步浸入组织替换脱水剂，再用不含脱水剂的包埋液将组织块包埋的胶囊内。包埋液是一种容易固化的混合液，固化后，其硬度和弹性足以保证切出厚度为50nm的均匀切片。
❹聚合： 即使包埋液固化的过程。此过程应尽量不影响组织的空间关系。
❺切片： 用超薄切片机和玻璃刀（或钻石刀）将包埋好的组织块切成厚度为50nm左右的切片。
❻捞片： 将切片捞在预先做好支持膜的铜网上(用环氧树脂包埋的标本，大切片可不用支持膜)。
❼染色： 用重金属溶液染铜网上的切片以增加组织散射电子的能力（增加反差）。
以下重点介绍比较关键的两个步骤——固定和包埋。(1) 固定： 电镜生物标本制备技术的第一个步骤。其目的是保存接近生命状态时的组织和细胞的亚细胞结构。理想的固定剂应能将细胞的溶胶状内容物不予损伤地立即固化，变成凝胶，从而固定其生前一瞬间的微细结构。固定之后，组织和细胞应不再受死后自溶、微生物侵害以及标本制备的其他步骤如脱水、包埋等的破坏。
固定的第一个问题是必须努力做到在组织尚处于生命状态时骤然进行离体和固定。否则，如全身或局部血液循环停止后，缺氧将很快影响组织的代谢和存活，引起细胞释放自溶酶而逐渐走向死亡。在电镜下早期的微小的死后变化也很易观察到。所以处死动物后应在尽可能短的时间内进行取材和固定。必要时可采用麻醉后取材或灌注固定法。
其次是固定剂的选择。目前尚无一种非常理想的固定剂。不同的固定剂各具优缺点。现在的趋势是采用两种或两种以上固定剂来代替早期只用一种固定剂，互相取长补短，可望达到比较完善的固定。
锇酸(OsO₄)是比较接近理想的固定剂，最早用于电镜标本固定。它与蛋白质之间发生化学结合形成交联，从而稳定了后者，而不是使后者沉淀。它对脂质的保存是通过与不饱和脂肪酸链形成复合物，故能较好的保存微细结构，特别是保存细胞的磷脂蛋白膜骨架。锇的物理密度非常高，可以产生电子反差，这是OsO₄的另一主要优点。
然而OsO₄与蛋白质和脂质的反应产物易溶于水，长时间固定更易溶解，因此固定时间应限制在2小时以内。OsO₄穿透组织的速率很低，每小时仅0.1～0.5mm，这一情况要求用OsO₄固定的组织块体积不得超过1mm³，否则组织的中央部分不可能得到充分固定。OsO₄与DNA的反应很弱，与RNA和大部分碳水化合物几乎不起反应，所以对核蛋白和糖原的保存欠佳。
为了弥补OsO4固定之不足，目前已常规用戊二醛作为第一固定剂，OsO₄作为第二固定剂进行双固定。戊二醛穿透组织的速度稍快，与蛋白质的反应也较快，有利于减轻固定过程中的提取现象和自溶变化，组织块的厚度可以增至1～2mm。戊二醛与OsO₄一样，是加成固定剂，即与蛋白质发生化学结合，通过交联稳定蛋白质，是优良的蛋白固定剂。它还能保存糖原以及各种酶的活性，适于电镜组织化学研究。但它不能保存类脂，如果不用OsO₄作第二固定剂，95%的类脂将在脱水过程中被提取，电镜照片上膜结构便会呈现出负像。若用OsO₄作第二固定剂，戊二醛固定和冲洗过程中溶解的磷脂遇到OsO₄，将形成髓磷脂图形——一种人为假象。用戊二醛长时间固定，这种人为假象则更加严重。在戊二醛固定剂中加入1～3mM的氯化钙可以防止这种情况的产生。
甲醛穿透组织的速度比戊二醛快，但它与蛋白质的反应不如戊二醛迅速，而且是可逆的。为了提高第一固定的质量，有人试用多聚甲醛（溶解后为不含甲醇的甲醛）与戊二醛的混合液作为第一固定剂。甲醛迅速进入组织，暂时将蛋白质稳定，随后而至的戊二醛再进一步将其较持久的固定。这种混合固定剂的效果比单独使用二者之一为好。
近年发现醋酸铀不仅是一个染色剂，而且还是一个固定剂。因此它也被用为第三固定剂。醋酸铀在较低浓度时(1×10-5M)便能稳定DNA，浓度稍高时(1×10-2M)除DNA外还能与多种蛋白质结合。此外，醋酸铀还与磷脂的磷酸盐基团结合，能稳定磷脂层使之不发生降解。在脱水前用醋酸铀水溶液作第三次固定，可以防止DNA蛋白质和磷脂在脱水过程中被提取，从而使细胞结构，特别是DNA与膜的结构获得更完善的保存和更清晰的对比。
固定的第三个问题是pH和渗透压对组织的影响。固定剂的pH超出6.5～8的范围会带来细胞微细结构的损伤。对戊二醛来说，pH不得高于7.5，以防止戊二醛发生聚合和丧失活性基团，所以固定剂都需用缓冲液将pH调至中性附近。固定剂与组织发生反应时可能释放H离子，后者在缓冲液中不难被除去。目前使用最普遍的缓冲剂是磷酸盐与二甲胂酸盐。
在戊二醛的作用下细胞仍保留其渗透性 （虽有一定变化），所以必须注意调整第一固定液的渗透压使与之相适应。根据试验，低张液与等张液的固定效果都不如稍高张的固定液为佳。固定液的渗透压不依赖于固定剂的浓度，而主要取决于缓冲液的离子强度以及外加氯化钠、葡萄糖和蔗糖等物质的浓度。不同组织和细胞对渗透压的要求不相同，须通过试验加以测定。第二固定液OsO4的渗透压不如第一固定液重要。
双固定的具体步骤如下：
❶第一次固定： 2%多聚甲醛+2.5%戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4，内含2.5mM CaCl2，于4℃固定1～2小时。
❷用0.1M磷酸盐缓冲液pH7.4，内含2.5mM CaCl₂，于4℃冲洗3次，共2小时或过夜。
❸第二次固定： 1%OsO₄的0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4，内含2.5mM CaCl₂，于室温固定1～2小时。
(2) 包埋： 目的是使标本通过制备从而适合于切出超薄切片。首先要使液态的包埋剂浸透整个标本。然后包埋剂进行聚合，形成较坚硬的物体。
常用的包埋剂有三种： 环氧树脂、聚酯树脂、甲基丙烯酸酯。在电镜问世的初期，最先采用甲基丙烯酸丁酯和甲酯作为包埋剂。这种包埋剂聚合后切片性能良好，然而体积收缩较显著，达到15～20%，造成严重的聚合损伤。其聚合体在电子的照射下很不稳定，容易蒸发，更加重组织的伤害。蒸发的气体还会污染物镜极靴，增加像散。因此自50年代末期环氧树脂和聚酯树脂被应用以来，甲基丙烯酸酯已不再用作常规包埋剂。不过水溶性的乙二醇甲基丙烯酸酯(GMA) 包埋对细胞化学的研究仍具有一定价值。
环氧树脂是目前使用最广泛的一类包埋剂，包括Ara-ldites (502,506,6005和CY212),Epon (812,815),Epok533,Maraglas655,DER (332,334) 和ERL4206等。其中Epon 812是世界通用的标准包埋剂。环氧树脂具有聚合均匀，体积收缩小和对电子束稳定等优点。凡是树脂都含有两种化学活性基团，即环氧末端基团和沿树脂链全长分布的羟基。环氧末端基团特别容易与含活性氢原子的胺结合，使树脂分子首尾相连，形成长链聚合体。分子中间的羟基能与酸酐等活性物质反应，形成树脂分子与分子间的侧链。因此当树脂、胺与酸酐一起混匀加热时，聚合可在三度空间进行。形成的聚合体体积收缩只有2%，细胞微细结构所受的损害很小。环氧树脂的稠度较高，因此浸透时间须比甲基丙烯酸酯长。其分子中间的羟基数越多，稠度也越大。
上述形成侧链的交联剂称为硬化剂或固化剂。常用的硬化剂为DDSA（十二碳烯琥珀酸酐）和MNA（甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐）。末端连接剂称为加速剂或催化剂，常用的有DMP-30 [2,4,6-三（二甲氨基甲基苯酚）]和BDMA (N-苯甲基，N-N-二甲胺)。
Araldite树脂CY212用MNA或DDSA做硬化剂，聚合后组织块非常硬，切片很困难，需要加入少量增塑剂使其具有弹性。常用的有DBP（邻苯二甲酸二丁酯）。环氧树脂618也需加入增塑剂。其配方如下：
环氧树脂618 6ml,DDSA 4ml
DBP 0.3～0.5ml,DMP-30 0.1ml
Epon 812的硬度可通过改变MNA与DDSA的比例来调节。MNA比例加大使组织块变硬，DDSA比例加大则组织块变软。其配方如下：

混合液A		混合液B
Epon812	62ml	Epon812	100ml
DDSA	100ml	MNA	89ml

混合液A与B的比例，大约在夏天为1∶9；在冬天为2∶8,DMP-30的用量为1.5%。
Epon 812与环氧树脂618的聚合条件是： 先在37℃12小时，然后提升至45℃12小时，最后在60℃聚合24小时。
多酯树脂Vestopal W多用于包埋较硬的标本，如细菌与植物组织。这种包埋剂非常粘稠，不溶于乙醇，因此应用比较局限。
冷冻蚀刻技术 近代电镜技术中一项重要而常用的技术。最早于1957年由Steere所描述，1961年后经Mo-or等人的改进而成为现今电镜室中常用的技术。其主要原理是，把低温冷冻的生物标本放在真空冷冻装置里折断，在新形成的折断面上喷镀一层铂金碳薄膜（即复型），打开真空罩取出标本，在腐蚀性溶液里把生物标本消化干净，让复型膜漂浮，打捞，进行电镜观察和照相，这样就可获得生物微细结构资料。
冷冻蚀刻的主要技术步骤如下：
(1) 标本的冷冻： 快速冷冻是操作的第一步。把生物标本投入由液态氮冷却和液化的惰性气体弗立昂(Freo-n22)内。近来也有人采用超速冷冻法，不用冷冻剂弗立昂而把液氮放到低真空缸里快速排气使温度突然下降(由-196℃降到-230℃左右)而达到目的。超低温冷冻旨在防止冰晶的形成。为了防止组织和细胞内的水分在冷冻时形成冰晶，一般还要把生物标本先浸泡在20～30%的甘油溶液中。在用甘油处理之前也可用缓冲的戊二醛稍加固定。
(2) 冷冻标本的折断： 将冷冻的标本装到真空罩内预先用液氮冷却的标本台上，同时冷却持刀台，待罩内真空达到10-5 Torr以上时，将标本断裂。因为断裂往往发生在细胞的膜性结构内，从而将不同部位的细胞器内部结构暴露出来以便于观察。
(3) 蚀刻： 使标本断裂面结冰的水分在真空内升华。由于细胞器的含水量不同，蚀刻后就现出高低不同的三维结构。细胞外间隙和胞浆基质含水较多，蚀刻（升华）较明显，而细胞膜则较少蚀刻，这样就产生了生物结构上的差别。
(4) 复型： 也叫作金属喷镀或投影，通常是使铂金等（蒸发源）与标本呈45°角向标本表面喷镀以形成薄薄的一层金属，然后垂直地喷镀上一层碳膜以加强复型的稳定性。
(5) 清洗： 喷镀之后，将空气导入真空罩内。此时带有表面复型的冷冻标本融化。把复型物放在强酸或强碱腐蚀性溶液里。为了加速消化可适当加温，待复型上沾连的生物成分腐蚀之后，再用白金耳将复型打捞到蒸溜水中清洗干净，最后以同法打捞至铜网上进行电镜观察和照相。
冷冻蚀刻技术固然有独到之处，尤其是在生物膜结构的研究上发挥了重大作用。但是目前技术本身还有某些缺点。这些缺点是： 裂断标本的盲目性较大，失败的概率较高；很难完全避免冷冻过程中冰晶的形成，因而难免出现某些人为假象。为了克服这些缺点，近来有人设计了双面对应复型，另外又采取提高真空和防沾污装置等措施。技术仍然在不断的发展之中。此外，对冷冻蚀刻图片的解释远比标本制作困难得多，因此要求研究者具有丰富的亚细胞结构知识和经验，使冷冻蚀刻揭露出来的无数微细结构能得到充分而正确地阐明。
扫描电镜标本制作技术 扫描电镜具有焦深长、视野广、显示三维立体结构、便于观察等许多优点，近年来在生物医学上应用愈来愈多。在生物学上用于昆虫学研究和器官及组织表面结构的观察，在临床医学上常用于各种血液病时血细胞的鉴别诊断。
在扫描电镜标本制作中最大的困难在于防止脱水引起的标本皱缩和变形。生物标本的共同特点是含水量多，大多数生物标本含水量都在80%以上，有的高达95%。要在电镜的高真空下观察生物标本，首要的问题是设法解决既脱水又能基本保持其自然状态的方法。为了达到此目的，发明了标本的冷冻干燥技术，其中最常用的是临界点干燥技术。
临界点干燥是利用CO₂在临界状态时相界消失而没有表面张力的特点，使生物材料达到干燥的目的。在一个密闭的耐压容器内，导入CO₂之后，很快就会达到相的平衡，即液态与气态的CO₂分子之间的互变达到动态平衡。当温度上升时，液态CO₂分子蒸发速度加快，气体的密度增加，而液体CO2的密度相应降低，达到临界温度时 (CO₂的临界温度是31.1℃)，气态和液态CO2的密度相同，气、液二相的差异完全消失，此时表面张力为零。继续维持在稍稍超过临界温度的条件下，缓慢地排出CO₂气体，当CO₂排尽时，标本也就干燥了。
临界点干燥的操作步骤如下：
(1)清洗和固定： 一般用缓冲液洗净组织表面，必要时，可用低频超声波处理(150W,2OHz处理数分钟)，使组织表面的粘液等物不致掩盖精细的表面结构。固定一般采用先戊二醛、后OsO₄双重固定法。经常规的梯度丙酮脱水，再用梯度的醋酸戊酯置换丙酮。因为醋酸戊酯与液化CO₂的置换十分容易，从而通过中间液置换后易于在耐压室内实现液化气的置换。
(2)液化气置换： 耐压室底部放滤纸数层，将标本放入耐压室后，拧紧密封盖，慢慢打开阀门，让液态CO₂进入耐压室。稍稍打开排气阀，将耐压室内原来的气体排出。往往可根据醋酸戊酯的气味来判断原来气体是否已排干净。关闭排气阀，导入CO₂使液态CO₂浸没标本(可通过玻璃观察窗观察CO₂的导入和升华情况)，直至液态CO₂钢瓶的压力与耐压室的压力相等时，液态CO再不能进入耐压室。
(3)加热： 目的是使耐压室内的液化CO₂发生气化，一般用60℃的温水加热即可。在加热过程中，操作者可通过观察窗直接看到CO₂气化的过程，即液面上升→界面模糊→一片混浊→透亮无色液体。此时耐压室内的压力因CO₂气化而不断上升，一般由钢瓶的60kg/cm²上升至105kg/cm²以上。
(4) 排气： 为了不致造成标本的膨胀损伤和CO₂的再次液化，应当控制排气速度，一般以每秒排10个气泡为宜。将排气管插入温水杯内，既可观察气泡的排气速度，又可避免排气管道由于产生干冰而造成堵塞。在排气时耐压室内的温度应维持在45～50℃，整个排气时间约需1小时。待排气孔处再无气泡排出时，说明排气完毕。打开耐压室，取出干燥好的标本，做最后一步处理。
(5) 真空喷镀或离子喷镀： 将干燥好的标本在立体显微镜下定好方向，并用导电胶或双面胶布粘到标本座上，按常规法放在真空喷镀仪内以旋转喷镀法喷上一层碳和金或放于离子镀膜机镀铂或金，其目的在于增加标本的导电能力，加强反差和增强标本的稳定性。
至此完成了扫描电镜标本的制备过程，可以进行扫描电镜观察了。
应当指出，在生物医学上仍然有一些质地较硬的标本，如毛发、指甲和骨质等不必经过脱水干燥，甚至也不必喷镀就可直接放入电镜进行观察。此外，在没有临界点干燥设备的情况下，用普遍空气干燥法也可进行一些有限的观察，不过，由于空气干燥人工损伤很大，在观察结果的解释上应十分谨慎。