氨基酸的活化

氨基酸活化就是氨基酰-tRNA的生成，而后者是氨基酸聚合所必需的活化形式。氨基酸须先和tRNA结合有两个原因。一是活化氨基酸利于肽键形成。未经活化的氨基酸在热力学上是难以使其羧基与另一氨基酸的氨基形成肽键的。二是氨基酰-tRNA的tRNA部分在氨基酸和mRNA之间起着配应体的作用。配应体是Crick在1955年指出的。当时已认为蛋白质上氨基酸顺序是由核酸决定的，但还未发现tRNA和氨基酸激酶。根据氨基酸侧链的理化性质，他指出核酸上实无与之互补的结构特点：既无可区分开缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的疏水性表面，也无可专与酸性氨基酸或碱性氨基酸结合的特异的带电荷区域。他提出每种氨基酸借助特殊的酶促作用而共价结合到一个小分子寡核苷酸上，从而借氢键与mRNA特异结合。这小分子称为配应体。当时设想的配应体是含3～6个碱基的寡核苷酸。配应体概念有三个要点：
❶各种氨基酸各有其关连的配应体，因此至少要有20种配应体；
❷各种氨基酸也各有特异的酶催化其与关连的配应体结合，也至少有20种酶；
❸配应体对mRNA的认别要准确无误方可保证蛋白质合成的忠实性。随后的实验结果证明了这假设是符合客观实际的，唯独配应体分子大小被低估了；现知tRNA含74～94个核苷酸。
氨基酸活化反应可列如下式：

这个反应实际是两步反应的总和：

在第一步，氨基酸以与酶结合的氨基酰腺苷酸形式而被激活，同时放出焦磷酸，这个与酶结合的中间产物可用凝胶法分离获得。第二步，氨基酸被转移到tRNA上，释放AMP，再生自由的酶。总反应是可逆的； 新形成氨基酰-tRNA的键的能量水平与ATP的高能键相当； 平衡常数低于1:缬氨酰tRNA是0.32，苏氨酰tRNA是0.37，精氨酰tRNA是0.25。这些测量所指示的高的基团转移潜力表现在聚合作用中易和氨基酸的氨基之类亲核物质起反应。总的反应虽是可逆的，但是通过焦磷酸酶使产物PPi水解为磷酸，阻止反应逆行，从而将反应平衡推向完全带上氨基酸的氨基酰tRNA。因此，一个tRNA的氨基酰化要有两个焦磷酸键被断开。
催化的酶过去称氨基酸激酶，现多称为氨基酰tRNA合成酶，本文简称合成酶； 其系统命名是氨基酸： tRNA连结酶 (EC 6·1·1.)。氨基酸和tRNA 3′末端腺苷的核糖以酯键形式相结合。使用3′末端2′或3′ 脱氧腺苷和酵母苯丙氨酸合成酶作研究，苯丙氨酸只和2′ 羟基结合。其他来源的苯丙氨酸合成酶和tRNAPhe 所得结果也都是这样。看来由苯丙氨酸合成酶催化经修饰的tRNA的氨基酰化作用，正常的结合位置在2′羟基。但非所有合成酶都这样。例如，酵母丝氨酸合成酶和大肠杆菌赖氨酸合成酶、组氨酸合成酶及甘氨酸合成酶，它们催化的氨基酰化却特异地位于3′羟基上。还有另一些合成酶，如大肠杆菌和酵母的酪氨酸合成酶，则对羟基位置无甚特别要求，既可在3′羟基上亦可在2′羟基上氨基酰化。因此，对2′或3′羟基的特异性与合成酶相关。不过在中性条件下，氨基酸可迅速从一个羟基转移到另一羟基，仅需毫秒时间即可达到平衡，此时70%是在3′羟基位，30%在2′羟基位。
反应(1) 是需要Mg2⁺的，但有时也可以Mn²⁺代替。精胺在个别情况下有促进酶活性的作用，但不能代替Mg2+。反应(2)的阳离子需求视tRNA和合成酶不同而异。在某些例子，Mg2+是必需的，另一些虽要有Mg2+但却可以精脒或精胺代替，还有一些则只要有足够的一价阳离子就可不需二价阳离子。虽有认为整个氨基酰化作用无须Mg²⁺参与的报道，但却发现tRNA或酶上仍隐藏着Mg²⁺，实际还是要有Mg²⁺。总之，Mg2⁺是氨基酸活化所必需的，尽管需要量可能甚微。氨基酸转移到tRNA可以不要Mg²⁺，而Mg²⁺或多胺在反应(2)的作用是稳定tRNA的结构。
在原核细胞中，一种氨基酸只有一种合成酶，虽然关连的tRNA可有几种。在真核细胞，有一套细胞质合成酶，每个合成酶可催化关连的一种氨基酸到所有同工tRNA。此外还有细胞器的合成酶，如在线粒体当中的。合成酶所催化的反应基本相同，但各种合成酶的结构相差却很远。根据合成酶的亚单位情况，可分为三类。第一类合成酶是由两个相同亚基构成的二聚体，即α2。亚基分子量为35,000～60,000，所以酶含两个底物结合部位。第二类是由分子量为70,000～120,000的单条肽链α构成的酶，只含一个底物结合部位。第三类为数很少，是含两种不同亚基各一对所组成的α₂β₂四聚体；整个酶含一个或两个底物结合部位。合成酶的底物有氨基酸、ATP和tRNA三种，所谓两个底物结合部位是指一种底物而言的。
合成酶表现出对其相关氨基酸的高度特异性，它不催化其他氨基酸的活化。尽管极个别情况能生成酶与非相关氨基酸和AMP复合物，如大肠杆菌的异亮氨酸合成酶也能形成酶Ile-缬氨酸-AMP复合体，不过对缬氨酸的Km比对异亮氨酸者高50倍，同时缬氨酸也不会稳定地结合到tRNAIle上，异亮氨酸合成酶会迅速催化可能暂时形成的缬氨酰-tRNA^Ile的水解。合成酶对原来细胞里可能遇到的天然的氨基酸类似物毫无活性，亦即某一给定天然的氨基酸类似物对同一细胞中的合成酶既非底物亦非抑制物，但该类似物对其他细胞的合成酶则可能是活泼物质。因此，有些氨基酸类似物由于特异抑制某合成酶而成为一种毒物，但合成该类似物的生物的合成酶对之并不敏感。合成酶通常仅对L型氨基酸有活性，但也有个别例外，如大肠杆菌酪氨酸合成酶对D型酪氨酸也有些活性，其Km高些，Vmax低些。氨基酸的自由氨基是必需条件，氨基被除去或乙酰化均使之失去作为底物或抑制物而与合成酶相互作用的能力。另一方面，羧基并非必需，氨基酰胺或氨基醇常具有相当于母体氨基酸Km的Ki。合成酶对另一底物ATP的要求相当严格，除了ATP之外，只有dATP略有活性，其他核苷三磷酸都无活性。至于ATP的类似物则或是抑制物或不活泼，唯AMP-P(CH₂)P和某些合成酶有作用。
合成酶对tRNA的识别是蛋白质生物合成中核酸信息的第一次参与。从进化上看，合成酶与tRNA的相互作用可能是蛋白质-核酸相互作用的首例。由于每种对氨基酸特异的tRNA都具有独特的反密码子，可以推想，合成酶只须读出该反密码子即可配上相应的氨基酸。有些合成酶果然如是，但大量实验表明这并非对所有合成酶适用的一般规律，一些合成酶并不以反密码子作为识别部位。酵母tRNA^Phe整个反密码子被切去仍保留20%活性，但酵母tRNAVal失去反密码子则完全无活性。还有随密码子中某一碱基改变而特异性改变了的例子。从某些大肠杆菌可分离出对终止密码子UAG和UAA读出谷氨酰胺的两个校正tRNA；它们都是tRNA^Try的突变株，原来的色氨酸tRNA反密码子有一个或两个C突变为U，使之可阅读原来的终止密码子。这改变还显然会使谷氨酰胺合成酶携带上谷氨酰胺，同时又阻止了色氨酸合成酶的作用。用化学方法引起大肠杆菌tRNATrp的C突变为U，结果同上，证明反密码子在该例中对特异性起着关键作用。也有tRNA其他位置一个碱基的改变而特异性也随之改变的例子。已经分离出6种sup3酪氨酸tRNA，它们都可受谷氨酰胺合成酶催化结合谷氨酰胺，并参与蛋白质合成。这6种突变株的各一个碱基改变了，位置分布在茎a首两对碱基和相邻的不配对的碱基。显然，在这区域里仅仅一个碱基的改变就使谷氨酰胺合成酶可以认别，而tRNATyr和tRNAGln的差别原来却是很大的，前者的茎d-环Ⅲ很大而后者环Ⅲ甚小。
用交联方法，或用合成酶-tRNA复合体保护tRNA的核酸酶水解等方法，可以测出合成酶和tRNA相互作用的区域。实验结果提示几处重要位置。一是氨基酸接受端，既然酶须把氨基酸结合到该处，显然要有接触。二是茎b的5′侧，该处是tRNAL型三维结构的内侧，处在L构造的转折。酶结合在L型构造内侧就可同时接触3′末端和茎b的5′侧，三是环Ⅱ；在一些酶-tRNA复合体中它接近酶蛋白； 结合在L型构造内侧的酶蛋白也可达到该处。因此，合成酶的结合可从3′末端直至反密码子，距离约为75A。一些酶可能只到达茎b，另一些稍为越过该处，跨度大小视复合体不同而异。
合成酶可和关连tRNA形成酶-tRNA复合物，不过它也可和非关连tRNA形成复合物，非关连的酶-tRNA复合物的解缔常数通常比关连者的复合物高几个数量级，但也有高得不多的。在前一种情况，特异性表现在结合水平上，即以Km作甄别； 后一情况就要在最大反应速度水平上来甄别。例如纯的酵母缬氨酸合成酶错误氨基酰化酵母tRNA^Phe和tRNA^Alα的Km只比正常氨基酰化分别高360和63倍。它们的Vmax只是正常氨基酰化作用的1～2×10-4。显然，可检出的错误氨基酰化只能见于不存在有相关连tRNA时。因此，高度特异性的氨基酰化作用不单纯依靠复合物形成特异性，而是多项因素相互作用的结果：
❶最大速度效应；
❷tRNA^A与tRNA^B对合成酶^A的竞争和合成酶^A和合成酶^B对tRNA^B的竞争；
❸合成酶催化的氨基酰tRNA水解作用。
合成酶的Km对氨基酸是在5～150μmol范围，对ATP是40～2300μmol，对tRNA是0.03～0.5μmol，多数接近0.1μmol。已经测出不少合成酶的最大速度，在10～2200mol(mol·min)范围。合成酶有三个底物，也有三个产物，可以预料一个底物对其他底物的结合有别构效应。tRNA对反应(1)的别构作用很突出，有时是必需的，有时促进，有时抑制，有时不活泼。以精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺为底物的合成酶，不论其来源是原核细胞或真核细胞，都完全依赖tRNA的别构作用。有这样的别构作用的tRNA必须具备完整的3′ 末端。而只起促进作用或抑制作用的tRNA，其3′末端虽失去了-C-C-A也仍有活性。氨基酸的结合可影响tRNA与ATP的结合，合成酶-tRNA复合体的解缔和缔合速度因氨基酸的存在而增高，但缔合常数保持不变。ATP可提高氨基酸对合成酶亲和力，反之，氨基酸也提高ATP亲和力。