异常血红蛋白检查

异常血红蛋白是指血红蛋白中珠蛋白分子结构异常，包括某些氨基酸缺失、过多、顺序改变或被替换等，其结果可改变血红蛋白的溶解度、稳定性以及与氧的亲和力，甚至引起疾病。目前已发现异常血红蛋白250种以上，一般按发现的先后依次用英文字母或以首先发现的地点命名。多数为先天性缺陷，少数为获得性异常。一般并不发生临床症状，只在偶然检查中发现，仅少数伴生理功能异常。我国近四十年来已发现29种异常血红蛋白和由于血红蛋白异常而引起的α及β地中海贫血。目前已对Hb J Bangkok、HbD punjab、HbG台北、HbG Cou-shatta和HbE的结构进行了分析，并取得了一定进展。
检查异常血红蛋白的方法很多，都是根据它的肽链氨基酸组合或排列异常引起的物理或化学性质的改变而设计的，常用的如下。
血红蛋白电泳： 是常用的一种分离和过筛异常血红蛋白的方法。不同珠蛋白有不同的等电点，在不同pH和一定离子强度的缓冲液中，血红蛋白在电场中可带不同的电荷，缓冲液pH大于其等电点时带负电荷，反之带正电荷，故各种血红蛋白都有它不同的泳动方向和速度，因此可通过电泳进行分离。若珠蛋白结构变异未引起等电点改变，则不能显示出异常血红蛋白区带。一般是在pH 8.6或6.5条件下电泳，图为在pH 8.6缓冲液中几种异常血红蛋白的相对移动速度。用作电泳的支持物很多，如滤纸、乙酸纤维素膜、淀粉凝胶、琼脂凝胶等。不同的支持物常显示不同的分离效果，有时须用多种方法协助分离鉴定。如指纹法是将血红蛋白液先用胰蛋白酶水解成多肽，然后用纸上电泳法结合双向层析，使各断裂的肽分散在纸上，根据肽的位置，加以洗脱、纯化。用氨基酸分析仪对血红蛋白的氨基酸顺序进行分析，则可更精确地鉴别血红蛋白氨基酸或短肽。还有将两种不同的血红蛋白混合在一起，其中一种为已知的异常血红蛋白或用人与犬的血红蛋白杂交，在酸性(pH 3.5左右)环境下，血红蛋白离解形成肽链，在中性或碱性条件下重行结合，自行交换，重新组成杂种分子，再进行淀粉凝胶电泳，观察电泳区带，这就是用以鉴别异常肽链的珠蛋白链杂交试验。

在pH 8.6缓冲液中几种异常血红蛋白的相对移动速度示意图

细胞学检查：
❶血红蛋白F (HbF) 细胞染色试验：HbF的溶解度低，对酸具有耐受性； 而HbA及HbA₂不耐酸，易被酸溶解。正常红细胞中不耐酸的HbA占96～98%,HbA₂占2～3%，耐酸的HbF不足2%。血片与酸性缓冲液接触后，几乎全部血红蛋白都被洗脱，染色液不能使红细胞着色以致仅留残影。如红细胞中的HbF增多，因它不能被酸性缓冲液洗脱，染色后红细胞呈红色。正常情况下成人无着色红细胞或<1%，新生儿的红细胞中HbF成分多，故多数着色，着色红细胞可达2/3,6个月后着色红细胞仅可偶见。此试验对HbF增多的β地中海贫血有一定诊断意义，重型者多数红细胞被染成红色，轻型只少数被染成红色。遗传性HbF增多症的红细胞都染成均匀红色，纯合子型的色深，杂合子型色淡，除此之外，有些白血病、恶性贫血、铁粒幼红细胞性贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等也可出现含HbF的红细胞，但数量很少；
❷红细胞镰变试验： 含HbS及HbC Harlem的红细胞，在缺氧状态下，由于其中的血红蛋白分子发生聚合，形成螺旋形体，致使细胞膜发生不规则扭曲，变成镰刀形。试验时可在血滴中加入还原剂除去红细胞中的氧，使血红蛋白转变为还原状态，在显微镜下观察红细胞有无镰变。正常人无镰变红细胞形成。当红细胞中HbS浓度>7%时，镰变试验可呈阳性。纯合子型的镰形红细胞性贫血含HbS 100%，可迅速出现镰变红细胞；杂合子型的HbS约占50%，镰变红细胞形成较慢，且数量较少。有HbS基因的新生儿，在出生后两个月内此试验转阴。含HbC Harlem的红细胞虽也能发生镰变，但镰变细胞很少；
❸HbC晶状包涵体试验： HbC存在时，红细胞经与3%氯化钠保温6h后，红细胞除呈靶形外，其中还可见到六角形及棒状晶状包涵体；
❹HbH包涵体生成试验：亦称煌焦油蓝沉淀试验，含有HbH或其他不稳定血红蛋白的红细胞，经与氧化还原染料煌焦油蓝在37℃保温后，HbH因氧化变性发生沉淀，红细胞中可见大小不等、数量不一、分布不规则的灰蓝色圆形小体称血红蛋白H包涵体，即变性珠蛋白小体。含HbH的红细胞经保温1h即可出现HbH包涵体。如系纯合子型者，在50%以上的红细胞中都可找到此包涵体。含有其它不稳定血红蛋白时，在此试验中也可发生珠蛋白变性沉淀，产生变性珠蛋白小体(Heinz小体)，但需保温24h。正常人者经保温1h后，含包涵体的红细胞不超过5%。含不稳定血红蛋白的某些严重溶血性贫血和轻型α-地中海贫血，有包涵体的红细胞也可超过正常。
血红蛋白溶解度试验： HbS在浓的无机缓冲液中，被连二亚硫酸盐(dithionite)还原后发生聚合沉淀，溶解度降低。HbC不能被沉淀，故溶解度较高。血红蛋白溶解度试验主要用于从人群中筛选HbS患者，阳性结果比较可靠，借以进行HbS与HbC的鉴别。将血红蛋白置于含连二亚硫酸钠浓的磷酸盐缓冲液中，与加有血红蛋白液的蒸馏水对照管比色，求出可溶性血红蛋白的百分率。正常人(陈悦书等主编血液学，第334页，江苏科学技术出版社，1980年):94.4%(88～102%)；杂合子Hb-A/S:51.6%(35～68%),Hb-S/F:14.6%(6～23%),Hb-S/C:40.4%(36～44%),Hb-A/C:93%(83～103%)。
抗碱试验： 正常血红蛋白在强碱条件下易变性，而HbF对碱的变性作用则有抵抗力，故可根据HbF的耐碱性以测定其存在与含量。定性试验是将血液滴入水中，再加入氢氧化钠。如血中HbF增加，则粉红色溶液转变为棕色的时间延长，正常人不超过2min。定量法是在定性试验的溶液中加入蛋白沉淀剂，使已变性的血红蛋白沉淀后滤去。HbF不发生变性，仍留在溶液中，进行比色法可测出其含量。成人男性正常值为0.17～2.27%，女性为0.13～1.56%，新生儿为55～85%,2岁以后降至2%以下。一些轻型β地中海贫血、α地中海贫血可轻度增高。重型β地中海贫血者HbF明显增加，抗碱血红蛋白可达30～100%。其它如F地中海贫血、A2F地中海贫血和γβ地中海贫血，增加亦较明显。δ地中海贫血则不增加。一些血液系统疾病如白血病、再生障碍性贫血等也可轻度增加。