层析技术chromatographic technique

利用混合物中各组分的物理化学性质差异，使其以不同速度移动的一种物理分离方法。
层析技术早在1903年就应用于植物色素的分离提取，各种颜色的色素从上到下在吸附柱上排列成色谱，也称色谱分离法。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辨力，从此引起了人们的广泛注意。随着人们认识和实践的提高以及物理化学技术的发展，应用范围更加广泛，没有颜色的物质同样可用此法分离，这时的工作全是使用吸附剂的吸附层析法。自1944年应用滤纸作为固定支持物的纸层析诞生以来，层析技术的发展越来越快。20世纪50年代开始，相继出现了气相层析和高压液相层析，其他如薄层层析、薄膜层析、亲和层析、凝胶层析等也迅速发展。在生物化学领域里，层析技术已成为一项常用的分离分析方法。
柱层析(LC) 又称经典液相层析，可分为吸附层析、分配层析和离子交换层析。
吸附层析 指混合物随流动相通过固定相时，由于吸附剂对不同物质的不同吸附力，而使混合物分离的方法。它是各种层析技术中应用最早的一类，至今仍广泛应用于各种天然化合物和微生物发酵产品的分离、制备。
吸附是表面的一个重要性质，任何两相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面的密集现象称为吸附。在固体与气体之间或在固体与液体之间的表面上都可以发生吸附现象。当气体或溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定的时间，然后才离开。这时气体或溶液中的组分分子在固体表面的浓度就会高于其在气体或溶液中的浓度。
在液体与气体之间的表面上，也可以发生吸附现象。凡能将其他物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂。聚集于吸附剂表面的物质就称为被吸附物。在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用，既有物理作用的性质又有化学作用的特征。物理吸附又称范德华吸附，因为它是分子间相互作用的范德华力所引起的。其特点是无选择性，吸附速度快，在相同条件下，吸附过程和脱附过程是同时进行的（可逆的），因此被吸附的物质在一定条件下可以被解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。层析过程就是不断地形成平衡与不平衡、吸附与解吸的矛盾统一过程。
纸上分配层析技术 各物质在两相中扩散速度不同，产生不同的分配系数。分配层析分离技术是利用各物质不同分配系数，使混合物随流动相通过固定相时而予以分离的方法。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中所具浓度的比例。不同物质因其性质不同而有不同的比例，也就是有不同的分配系数。现在应用的分配层析技术，大多数是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂，此极性溶剂在层析过程中始终固定在此多孔支持物上而被称为固定相。另用一种与固定相不相溶的非极性溶剂流过固定相，此移动溶剂称为流动相。如果有多种物质存在于固定相和流动相之间，将随着流动相的移动进行连续的、动态的不断分配，由于各种物质的分配系数相近，移动距离就必须相当长才能分开。反之，两种物质的分配系数相差越大，彼此分开时的移动距离就越短。因此，必须根据实际情况，选定作为固定相用的层析柱或滤纸的长度。
分配层析中应用最广泛的是以滤纸为多孔支持物的纸上分配层析。其次是以硅胶、硅藻土、纤维素粉、淀粉、微孔聚乙烯粉等多孔支持物的分配层析。还有直接使物质在两种不相溶的溶剂中进行分配的常压液相分配层析和高压液相分配层析。
分配层析以分配系数为依据，在等温等压条件下可用下式表示。K=K2/K1，式中K为分配系数；K2是物质在固定相中的浓度； K₁是物质在流动相中的浓度。分配系数与温度、溶质和溶剂的性质有关，各种物质有不同的分配系数。
纸上分配层析已有近50年的历史，由于其设备十分简单、价廉，所需样品少，分辨力一般能达到要求等优点而被广泛应用。纸上分配层析可用于物质的分离、定性及定量，对氨基酸、肽类、核苷及核苷酸、糖、维生素、抗生素、有机酸等小分子物质都很适用，但对核酸和蛋白质大分子的分辨力不高。在发酵工业中，常用于菌种筛选阶段的物质鉴定。
纸上分配层析是以滤纸为惰性支持物的。滤纸纤维和水有较强的亲和力，能吸收22%的水，而且其中6～7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以一般的纸上分配层析实际上是以滤纸纤维及其结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。当有机相沿纸经过样品点时，样品点上的溶质在水相和有机相之间进行分配，一部分溶质离开原点随有机相移动，进入无机溶质区，此时又重新进行分配，一部分溶质从有机相移入水相。当有机相不断流动时，溶质也就不断进行分配，沿着有机相方向移动。溶质中各种不同组分有不同的分配系数，移动速率也不相同，从而使物质得以分离和提纯。
溶质在纸上移动的速率可用R_f值表示。

R_f值决定于被分离物质在两相间的分配系数和两相间的体积比。由于两相体积比在同一实验条件下是一常数，所以Rf值主要决定因素是分配系数，不同物质分配系数不同，Rf值也不同。
薄层层析分离技术 将作为固定相的支持剂 （吸附剂或其它）涂于支持板上（一般为玻璃板） 进行的一种层析技术。如果支持剂是吸附剂，层析时的主要依据是吸附力的不同，应属吸附层析，又因此种吸附层析是在薄板上进行，故名薄层吸附层析。如果支持剂是纤维素，其层析的主要依据是分配系数的不同，应属分配层析，因在薄板上进行，故名薄层分配层析。同理，薄板上涂以离子交换剂，分离作用的主要依据为离子交换而名薄层离子交换层析； 薄板上涂以凝胶过滤剂，分离作用主要依据为分子量的大小，而名薄层凝胶层析。
各种薄层层析的原理与其对应的柱层析原理相同，但比其相应的柱层析具有更多的优越性。它同柱层析一样，可选择不同的支持剂和不同的处理方法进行薄层层析，它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点。同时，层析速度快，一般仅需15～20分钟，混合物易分离，分辨力一般比纸上层析高10倍，甚至100倍，它既适用于只有0.01微克（一般用几十微克）的样品分离，又能分离大于500毫克的样品作制备用，而且可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。由于薄层制备利于规格化，重现性也较好，滴加样品后可立即展层，不受温度等影响，因此发展较快，应用较广。缺点是对生物高分子物质的分离效果仍然不佳。
聚酰胺薄膜层析 是指混合物流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的强弱不同，而将混合物分离的方法。
聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新的层析法，特别是用于氨基酸衍生物(如DNS-氨基酸、DNP-氨基酸)的分析时，此法灵敏度高、分辨力强、操作方便、速度快。在蛋白质化学结构分析中，聚酰胺薄膜层析与Edman-DNS法结合形成一种顺序分析的超微量方法。
聚酰胺是一类化学纤维原料，国外称尼龙，中国称锦纶，由己二酸与己二胺聚合而成的叫锦纶66; 由己内酰胺聚合而成的叫锦纶6。这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。自1955年发现聚酰胺对极性物质有吸附作用以来，聚酰胺作为氢键吸附剂用于柱层析和薄层层析等已有不少报道，而聚酰胺用于薄膜层析则是进一步的发展。目前已应用于16类化合物的分析(酚类、酚类糖苷、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料、磺胺、抗生素、环酮、杀虫药、维生素B、抗热药物)。
聚酰胺具有特异的层析分辨能力，它对极性物质的分离吸附作用，是由于与被分离物形成了氢键。如酚类和酸类是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键，硝基化合物与醌类是与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，决定了吸附力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺粒子表面竞争形成氢键，可选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有最大差异，经过吸附与解吸的展层过程，形成一个分离顺序。
气相层析 也称气相色谱。它与一般层析法的区别主要在于用气体代替液体作为扩展剂或洗脱剂，因此也同样有吸附气体层析法（气固层析法）和分配气体层析法（气液层析法）两种操作形式。实际应用中以后者为常用。气液层析法自1952年发表以来发展迅速，目前已形成了一门独立的分离分析技术，其应用范围自石油化学部门扩展到有机、生化、高分子、药物、无机等领域，凡是可以汽化的或设法保持有挥发性的物质几乎都可分析。其特点是： ❶气体粘度小，气相与液相（固定相）间的质量传递率高，容易达到平衡，当使用高的气相流速时可缩短分离时间，分析常在几分钟到几十分钟内完成，使用长的层析管能提高分离效率；
❷检定气体中的组分比检定液体中的组分容易，已有许多简单与灵敏的仪器可以利用，并可设法使检定工作自动化，节省人力和时间，它也可与红外、质谱等组合以提高分析效果；
❸气液层析法中固定相液体的选择范围很广，操作温度范围也很宽，两者配合，可将结构相似或沸点相近的物质分开；
❹检定器灵敏，样品用量很少，一般固体样品只需若干μg至mg；液体样品量1μl至几百μl；气体样品0.1 ml至10ml。
混合物样品随固定流速的载体（常用惰性气体）进入层析柱。样品必须是气态的，如为液态或固态则需先气化再进入层析柱。层析柱内装有称为担体（树脂）的颗粒状隋性支持物，其表面为一类具有高沸点的有机化合物（称固定液）均匀地包裹着，使担体表面形成一层很薄的液膜。样品气体进入层析柱遇到这种固定液时，就能溶解在固定液中，遇热又能挥发到载体里去，并随载体的定向流动而向前推进，以至又遇到新的固定液而被吸收。如此交替地吸收和挥发，使样品蒸汽所经过的每一个点上都进行着固定相和流动相之间的分配平衡，由于样品中各组分在固定液和流动相里的溶解度不同（即分配系数不同），在层析柱内向前移动的速度也不相同。分配系数大的组分，易溶于固定液内，在固定液中停留的时间就长些，移动的速度也就慢些，分配系数小的组分不易溶于固定液，移动速度就快。经过一段时间后，原来均匀混合的样品组分彼此就分开了，被分离的组分按先后次序被载体带入鉴定器，在那里把进入的样品浓度转换成电压，经放大后在自动记录仪上记录下来，得到气相层析曲线图。从给样到每一组分出现在层析峰上的时间称保留时间，不同化合物在一定条件下有其特定的保留时间。还可根据峰面积来计算各种化合物的浓度。
高压液体层析 又称高效液相层析（或色谱）。其分离分析原理和经典的液体层析基本相同，但它采用了特有的固定相液体，加上在高压下工作，又与自动分析仪器相结合，成为一种高效的分析方法。广泛用于药物、杀虫剂、高分子量芳香族化合物、增塑剂、抗生素、各种有机试剂以及核酸、核苷酸类物质的分离分析。
高压液体层析特点是采用长 (50～100cm) 而细(柱径2～3mm)的层析柱，柱内填充物的粒度较细(直径10～15μm)，在高压下操作，因而分析速度很快。一般可分为以下4类：❶液-液分配层析。利用溶质在流动相中分配系数的差别而达到分离的目的，是应用最多的方法之一；
❷液-固吸附层析。利用溶质在固体吸附剂上吸附能力的差别，而达到分离目的；
❸离子交换层析。通过溶质和担体的离子交换作用，利用不同溶质离子交换能力的差别，而达到分离目的；
❹凝胶渗透层析。按溶质分子量大小而分离，也即分子筛层析。
高压液体层析中常用的担体是聚苯乙烯凝胶、多孔性二氧化硅微球、多孔玻璃珠等，这些层析担体对高分子化合物及表面活性剂的分离很有效。

层析技术

chromatography technique