分离规律的验证fenliguilu de yanzheng

杂交第一代的一对位于同源染色体上处于杂合状态的等位基因，在形成配子时彼此分离到不同的配子中去，配子的分离比是1:1，所以测交后代的表现型分离比是1:1，而F₂代基因型分离比是1:2:1。若显性完全，则F2代表现型分离比是3:1。据此原理，选取具有一对相对性状差异的两个果蝇品系为亲本进行杂交，观察F2或测交后代的相对性状的遗传表现，以验证孟德尔的分离规律。
黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) 有不同品系： 长翅 (VV) 和残翅 (vv) 品系，或灰体 (EE) 和黑檀体(ee) 品系。V-v基因座在第2染色体上。长翅： 翅膀超过尾部。残翅： 几乎没有翅膀，仅有一点残迹，无飞翔能力。E-e基因座在第3染色体上。灰体：身体呈灰色。黑檀体： 身体呈乌黑色。
果蝇培养基的配制有多种方法，这里仅介绍配制方便、价格低廉的玉米粉培养基的制备方法，其配方为：玉米粉10克、红糖13.5克、琼脂1.5克、苯甲酸0. 15克 (或丙酸0. 6毫升)、水74. 3毫升、酵母粉少许。其制备步骤如下：(1)将琼脂切碎放入约为总量2/3的水中煮溶后，加入糖（红糖或白糖）搅拌。(2)将玉米粉和余下的1/3水调成糊状倾入正在煮沸的琼脂糖溶液，不断搅拌，继续煮沸几分钟，加入苯甲酸(事先用少量的95%酒精溶解)，如无苯甲酸可加入丙酸，不断搅拌直至混合物粘稠均匀为止。(3)趁热将配制成的培养基倒入培养瓶（广口瓶或大试管），其厚度约3～4厘米，培养基内可插入一小片消过毒的滤纸，以便于成虫栖息和幼虫化蛹。(4)将盛有培养基的培养瓶放入高压锅中进行高压消毒，压力为1公斤/平方厘米，时间约20～30分钟。或将广口瓶或大试管（均带棉塞）放在烘箱内加温至160℃时切断电源，使其自然冷却，然后将刚煮好的培养基倒入广口瓶（或大试管）内，立即加塞，备用。(5) 用时加少量酵母粉 （也可不加）。本实验仅选用翅膀性状。让长翅果蝇与残翅果蝇交配，所得的子一代(F₁)都是长翅，子一代的雌雄个体互交，子二代(F₂)出现了性状分离现象，即出现两种表现型，并且长翅数目与残翅数目之比为3:1。如将F₁与残翅果蝇进行测交，则测交后代也出现两种表现型，但长翅数与残翅数之比为1:1。
F₁ (Vv)可产生V型和v型两种数目相等的配子，雌雄都是这样，于是F₁互交时，F2为1/4VV+1/2Vv+1/4vv。由于V对v呈完全显性，基因型VV和Vv都表现为长翅，而vv表现为残翅，所以F₂的长翅数与残翅数之比为3:1。而测交时，隐性亲本残翅果蝇(vv)只能产生v型配子，故测交后代的长翅 (Vv) 数与残翅数(vv)数的比是1:1，上述两种结果均证实F₁在减数分裂时，等位基因分离而形成V型和v型两种数目相等的配子。实验步骤如下： (1)确定杂交组合：正交为长翅 (VV) ×残翅(vv) ，反交为残翅(vv) ×长翅(VV)。正确鉴别果蝇的性别是杂交试验的关键，现列出肉眼（或用放大镜）可见的成熟、果蝇的主要区别：

一般用肉眼对果蝇的体型和腹部特征进行观察即可快速、准确地把雌、雄果蝇区别开来，以保证杂交实验的可靠性。(2)选取处女蝇：由于雌蝇生殖器官有贮精囊，1次交配可保留大量的精子，可供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。已知刚孵出来的幼蝇在12小时内(8小时内更为可靠)不交配，所以一般做法是：将培养瓶内的所有果蝇全部移出，在12小时内收集刚孵出的幼蝇，并将雌雄蝇分开培养，所得的雌蝇即为处女蝇。(3)杂交：按预定组合，在麻醉状态下选出10～20对雌（处女蝇）、雄蝇放在培养瓶中进行杂交培养。具体做法：首先选用与培养瓶口径相同的带盖（盖底部塞入少量脱脂棉）广口瓶，作为专用于麻醉果蝇的麻醉瓶，使用时，先滴数滴乙醚到脱脂棉上。欲对果蝇进行麻醉时，先将果蝇培养瓶与麻醉瓶瓶口相对，培养瓶在上，倒立，麻醉瓶在下正立，一手拿住上述二瓶，另一手轻拍培养瓶，使果蝇落入麻醉瓶中，迅速将两瓶塞住。或者培养瓶在下麻醉瓶在上，去塞对接瓶口后用双手遮住培养瓶，于是果蝇因趋光而移入麻醉瓶中，达到一定数量后，立即将二瓶盖好。约经半分钟后果蝇即被麻醉，并倒在白瓷板上进行观察、挑选，要注意不能麻醉过度，如果蝇翅膀外展和身体呈45度角即表示果蝇死亡。将培养瓶（含新培养基）横卧，用毛笔把所选的果蝇放在瓶壁上，塞好瓶口，待果蝇清醒后再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在培养基上。在瓶上贴好标签，注明杂交组合、日期和实验者姓名，然后放在23℃的温箱内培养，正反交的方法相同。(4)移出亲蝇：杂交7～9天后，在F₁果蝇即将孵出以前（部分蛹已变黑时），将亲蝇全部移出，以防止亲子代混杂。(5)F¹果蝇的观察：在F₁果蝇孵出后7～9天内观察其表现型，F₁应表现为长翅显性性状，若有残翅隐性性状说明该杂交试验失败。(6)F1互交或测交：分两种处理。F1互交：选取F₁约10～20对雌雄果蝇（此时不一定选用处女蝇）移入新培养瓶中，以繁殖F₂代。测交：选取F₁的处女蝇与残翅雄蝇约10～20对移入另一新培养瓶中，进行测交后代培养。(7)移出亲蝇：交配7～9天后，将上述两种处理的亲蝇移出培养瓶。(8)观察和统计：在F₂代或测交后代的果蝇孵化后7～9天内，对F₂代和测交后代定期(每隔1或2天)收集观察、和统计，将调查结果分别填入下表：

(9)数据处理：将正反交的F₂或测交后代的观察数据合并后填写下表：

运用X²（卡平方）测验法对F₂代或测交后代的实验结果进行检验，看其实验观察值与理论值是否相符，Z²的计算公式如下：

式中O_i为第i类的观察个体数，E_i为按预期理论比(F₂代为3:1，测交后代为1:1)算出的第i类表现型理论数，n为观察的类型数(这里n为2),n-1为自由度。算出X²值后，再根据自由度查X²表。
X²表中第1列f表示自由度，其余各列表示在一定自由度下X²大于表中数值的概率P。所以由自由度可查出相应的P，再依P值判断观察数与理论数的差异是否显著；当P>0.05时则差异不显著，若P≤0.05时则差异显著。或者查出显著水准(即P值)在0.05时的

X²临界值，然后将其与实得Z2值比较，若实得X²≥临界值，则观察值与理论值差异显著；若实得X²值<临界值，则观察值与理论值差异不显著。现举例说明，例如，F2代果蝇数为185个，其中长翅数为134，残翅数为51，观在要检验该结果是否符合理论结果，先假定该实验结果的长翅与残翅之比符合3:1，于是长翅的理论数为185׳/4查自由度为1 (2-1)时X2表，得知P在0.5～0.3.即凭机会发生这样差异的概率介于0.5和0.3之间。这里P>0.05；或者查到显著水准为0.05(P=0.05)时的临界值为3.84，此处实得X2值0.65，小于临界值3.84。最终，可得出结论，即观察数与理论数差异不显著，可以接受3:1的理论假设，所以该实验结果的长翅数与残翅数符合理论比即3:1