农药代谢研究法research methods ofmetabolism

包括研究农药在生物体内的代谢动力学（即量的变化）的方法和对代谢产物进行鉴定的方法。
种类 代谢研究在40年代末至50年代初用的是化学方法。50年代以后同位素示踪技术被用于代谢研究；进入70年代，气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法、红外光谱法、核磁共振法、计算机技术也相继被应用于农药的代谢研究。其中质谱法、红外光谱法及核磁共振法只能用于定性分析。而同位素示踪法既可以作定量分析，也可以作定性分析，是农药代谢最常用的研究方法。其原理是利用一种元素的同位素具有相同的物理、化学和生物学性质，而具有不同的核物理性质。如果用放射性同位素代替原分子中的稳定性同位素，就可以使农药分子带有可示踪的特点，它与正常农药分子一样参加各种化学反应，并保持其示踪的特性。通过用核子仪器测量放射性同位素辐射特征的方法，再结合其他方法手段，即可对农药的代谢产物进行定性和定量。
步骤 农药的代谢研究大体上包括以下三步：试验对象的处理、样品的提取和纯化、代谢产物的分离和鉴定。
试验对象处理 农药代谢的生物对象包括动物、植物和微生物。
试验动物处理 动物代谢试验包括活体代谢、离体代谢和总量平衡试验。其试验对象各不相同，处理方法各异。❶活体代谢：试验对象为动物活体。以哺乳动物为例，供试动物通常为大鼠，并要用与慢性毒性或致癌试验相同的品系。供试用药应将¹⁴C标记在农药分子中的稳定部位。投药方式一般采用口服，可一次投药或连续投药。投药量由急性毒性试验结果决定，可选显示毒性和药理效果的量及无作用剂量。试验时间应持续到大部分药量(95%)被排泄或7天左右。在试验过程中要对血、粪、尿和呼出气体随时进行分析；还要测定宰杀时组织、脏器中总¹⁴C量以及有机溶剂可萃取物质和不可萃取残渣中¹⁴C的量。对尿、粪提取液中代谢物作定性与定量测定。除此之外，根据情况还可以进行胆汁排泄物中农药代谢物的定性定量等项目的测定。
❷离体代谢：试验对象为动物脏器。其目的是弄清动物体内的药物代谢转化以及解毒作用和活化机制。处理方法是，首先按试验目的从动物脏器中提取和制备必要的酶并进行培养，然后与作为底物的、用放射性同位素标记的农药进行反应，再经提取、分离，最后对未分解的底物和代谢物进行定性和定量分析测定。哺乳动物的肝脏担负着药物代谢的主要任务，因而肝脏酶系最常用，哺乳动物肝脏酶系有多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶、羧酸酯酶、芳族酯酶等酶系。多功能氧化酶是药物代谢酶系中最重要的酶系，它还存在于哺乳动物的其他脏器和昆虫的消化道、脂肪体中，植物和微生物体内。在动物体内与农药代谢有关的酶系，还有醇脱氢酶、醛脱氢酶以及某些能促成轭合物形成的酶系等。
❸总量平衡(total balance)试验：试验对象为动物活体和各种排出物，即要分别测定供试动物体内、排泄物及呼出气体中所含放射性物质的量，用以判断农药在生物体内的累积性能，查明农药的归趋。总量平衡试验装置示意图如图1、图2。

图1 大鼠、小鼠代谢实验装置
(据山本 出，深见顺一)

试验植物和微生物处理 农药的植物代谢和微生物代谢试验对象的处理较动物代谢简单。植物代谢通常用放射性标记农药直接处理植物的根系和叶。根系处理通常是将放射性标记农药配制成一定浓度的营养液，然后将供试植物的根部浸入营养液中，叶面处理通常用微量注射器将药液

图2 昆虫代谢研究用¹⁴CO₂和挥发性化合物捕集装置
(据山本 出，深见顺一)

涂抹在叶面。根系和叶面处理的药剂作用时间视药剂在植物体内代谢降解速度而定，一般为1天、3天、6天、12天等。微生物代谢研究通常是将放射性标记农药直接加入到含微生物的土壤和水中进行代谢降解研究。
样本提取和纯化 在提取样本时，应选择合适的有机溶剂作为提取剂。通常作为提取剂的有机溶剂有正己烷、丙酮、甲醇、乙腈等，也可以用混合溶剂进行提取。由于在提取过程中，有些杂质（样本自身所含的一些物质）有可能与农药分子及其代谢产物一起溶入提取剂中，其中有些组分可能会对代谢产物的鉴定产生干扰，因此须对提取液进行纯化处理，尽可能地除去干扰杂质。常用的纯化方法有液液分配法、柱层析法、薄层层析法等。提取液中如果代谢物含量甚微，有时可能被杂质吸附而不能被提取，有些代谢物也可能在提取或纯化过程中发生分解，为防止上述情况的发生，样本的提取与纯化过程应在低温下进行，并作添加回收率试验。提取过程中，样本中能溶于提取剂中的农药母体化合物和代谢物称之为可萃取物质，需对这些可萃取物质所包含的成分进行定性与定量分析。不能溶于提取剂的称之为不可萃取物质，即通常所说的结合残留。
代谢物分离和鉴定 在提取过程中，溶于提取剂中的物质往往是多组分混合物，鉴定前须使各组分分离，其方法有：❶薄层层析法是最常用的分离手段，展开后的薄板，采用喷涂发色试剂、放射性自显影等方法与标准品斑点相比较，即可达到定性分析的目的。若须对斑点上的化合物定量测定，可刮下薄板上相应部位的硅胶并溶于适当的有机溶剂中，再用仪器测定。
❷全自动放射性薄层扫描仪法是近年出现的新方法，可对展开后的薄板上各放射性斑点直接扫描画出色谱图，并由计算机系统算出色谱图中各个峰的Rf值（定性依据）及峰面积（定量依据）。
❸用气相色谱法或高压液相色谱法对代谢物进行定性和定量分析。上述定性与定量方法的一个前提是必须有标准品作为对照。在没有标准品的情况下可将代谢物用柱层析或制备薄层层析法反复分离精制，然后用质谱法、红外光谱法、核磁共振谱法等方法确定化学结构。
水溶性代谢物中的轭合物是由农药母体化合物或代谢物和生物体内某些轭合剂结合形成的大分子物质（见轭合残留）。为了弄清它们的结构，通常先用酶或用酸、碱使轭合物水解，继之用薄层层析法分离水解产物，再用上述方法进行定性与定量测定。
不溶于提取剂的结合残留只能用放射性同位素示踪法测定，即用氧化燃烧法把结合残留中所含的¹⁴C转变成¹⁴CO₂³H转变成³H₂O。生成的¹⁴CO₂和³H₂O分别被仪器自动捕集后，用液体闪烁计数器测定其放射性活度。氧化燃烧法只能对不可萃取的结合残留中所含的放射性物质定量测定，而不能定性分析。若要对结合残留进行定性分析，可用汗(S.VKhan)等人曾报道过的管式炉对含有¹⁴C标记农药结合残留的样品进行氦气保护下的高温蒸馏。馏出物被引入一组分别盛有甲醇，含25%盐酸的甲醇以及碱性吸收液的吸收管内，被捕集的馏出物经纯化处理后进行分析鉴定。（见结合残留）
注意要点 应用同位素法进行农药代谢研究、同位素种类的选择、标记位置的确定以及化合物的比度和纯度十分重要。在放射性同位素法中，通常选用的放射性同位素是¹⁴C和₃H。前者标记体稳定，半衰期长达5730年；后者标记体稳定性较差，半衰期12.3年，放射性活度也较弱。还有³²P(半衰期14.3天)和³³P(半衰期25.2天)虽然放射性活度较高，但因其半衰期太短而使应用范围受局限。其他如³⁵S(半衰期87.4天)和³⁶Cl(半衰期3.07×10⁵年)等标记的化合物在农药代谢研究中也有应用。放射性同位素原子在农药分子中的标记位置，应根据农药分子的特征及试验目的确定。比如，有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类农药化合物分子中酯键处易发生断裂，不宜作标记位置，而应尽可能标记在分子中比较稳定的位置（如苯环）。有时根据研究目的也可以在同一化合物分子中采用不同的标记位置或不同的同位素进行标记。如在进行氨基甲酸酯杀虫剂克百威代谢研究时，¹⁴C被分别标记在分子中的苯环(¹⁴C-环-克百威)和羰基(¹⁴C- 羰基 -克百威)两个不同位置 上。在稳定的苯环上采用¹⁴C-标记有助于研究农药分子在生物体内外形成结合残留及在微生物作用下完全分解形成¹⁴CO₂的过程。用于农药代谢研究的放射性化合物比度：¹⁴C标记化合物通常控制在3.7×10⁷～3.7×10⁸贝可/毫摩尔，³H标记的化合物因其放射性活度较弱，放射性比度一般比¹⁴C标记化合物的比度高5～10倍。代谢研究用的放射性化合物纯度一般要求达98%以上。
此外，还应考虑同位素效应。所谓同位素效应指的是，一种元素的各个同位素所组成的同一化合物，它们的性质并不绝对相同。这种性质上的差异所造成的化学反应差异就是同位素效应。尤其是原子量较小的元素，其同位素效应较为明显。比如，²H的原子量是¹H的2倍，³H是¹H的3倍，使它们在物理学、化学和生物学的性质上表现出一定的差异。试验证实：氚水(由³H和O原子组成的水分子)和其他化合物进行反应时，其反应速度比普通水的反应要慢。又如14C标记化合物在生物体内的反应速度及其生成物的产率，也往往比相应的非标记化合物为低。这些同位素效应在进行示踪试验时应予考虑。