免疫检测法immunoassay

将抗体抗原反应与现代测试手段相结合的微量分析方法。免疫是机体识别和排除抗原性异物而产生抗体的一种保护性反应，免疫反应即抗体抗原反应，不仅发生在生物体内，在体外亦能进行，而且是高度特异性的。因这种反应难以检测到，须以荧光素、放射性同位素或酶等可用现代测试仪器检出的物质标记抗原或抗体，据此建立了 一系列免疫检测法，广泛用于生物化学、内分泌学和临床化学。1968年森特诺(E.R.Centeno)等人制备了抗滴滴涕和马拉硫磷抗体，应用放射免疫法检测这两种农药，标志着农药免疫检测技术的开始。免疫检测法具有高度特异性和灵敏性，在农药残留分析中的应用迅速发展，到目前为止，已有几十种杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物生长调节剂等使用此法进行测定。
原理 免疫系统有两类功能：非特异性免疫是先天遗传的 一系列防卫功能；特异性免疫是个体在生活过程中与某种抗原物质接触后产生的 一种防卫功能，又称后天获得性免疫。构成抗原的条件有3个：❶异物性。绝大多数抗原是机体的外来物质；
❷具有能与相应抗体发生特异性反应的能力。是由抗原表面的特殊化学基团即抗原决定簇的性质、数目和空间构型所决定；
❸分子量大。通常在6000～10000以上，分子量越大，其表面的抗原决定簇就越多。抗原具有两种性能；❶免疫原性。刺激机体免疫系统而产生抗体的性能；
❷反应原性。与抗体在体内、外发生特异性结合反应的特性。具有免疫原性和反应原性的称为完全抗原，如细菌、病毒、动物血清等；缺乏免疫原性，只具有反应原性的是半抗原；半抗原与蛋白质分子偶联形成人工抗原后，才具有免疫原性，化学农药的分子都比较小，是半抗原。抗体是机体内一类能与抗原发生特异性结合反应的球蛋白，存在于血液、淋巴液和组织液中；按其来源可分为天然抗休与人工抗体，人工合成的农药抗原接种于动物后产生的抗体，属于人工抗体。抗体和抗原的结合不仅是高度特异性的，还遵循质量作用定律，即与抗体或抗原的浓度成比例，其分子间弱的结合力是多个非共价键力的总和，取决于抗体和抗原表面各基团的相似性，免疫检测法就是利用这一原理。
步骤 利用免疫检测法进行农药残留分析，必须先制备抗原和抗体，然后标记抗原（或抗体），进行竞争结合反应，根据反应物含量变化，求出待测农药浓度。
抗原制备 免疫原性好的抗原是获得特异性抗体的关键。农药作为半抗原必须具有氨基(—NH₂)、羧基(—COOH)、羟基(—OH)或巯基(—SH)

等反应活性基团才能与蛋白质偶联；还应具有3～ 6个碳链长度的间隔臂(spacer arm)，才可以突出与蛋白质偶联后抗原分子表面上具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团，即突出抗原决定簇。大多数农药不具备上述活性基团和间隔臂，必须进行衍生化，不同衍生化方法的产物是不相同的。以除草剂禾草特为例，衍生化后的半抗原有带羧基(A,B)和氨基(C,D)4种。
衍生化时应尽可能不改变半抗原分子中抗体识别基团的大小、形状、化学结构和立体构型等，因为半抗原分子结构的任何改变都会影响抗体的特异性和亲和力；相同的农药亦可在其分子的不同部位进行衍生化，得到不同特异性的半抗原。用作载体的蛋白有许多种，最常用的是牛血清蛋白、人血清蛋白，其他如兔血清蛋白与卵血清蛋白亦可使用。结合的半抗原分子与载体蛋白质的分子比称为抗原结合比，制备的人工抗原必须测定其结合比。
抗体制备 用人工抗原免疫动物时，机体内产生抗体，最常用的是体液抗体，存在于动物血清中。供免疫用的动物有羊、家兔、白鼠等。免疫剂量是影响抗体生成的因素，在免疫注射时应多设几个剂量，以每千克体重几十微克到十几毫克；可在不同间隔期免疫多次，在最后一次免疫后第七天采血试效价；抗血清的效价是指抗体和抗原发生可见反应的最大稀释度，稀释度愈大，效价愈高，血清效价达到要求后即可采血，并将制得的抗血清分瓶包装，于-20℃以下存放。
检测方法 根据标记物质不同，免疫检测法有荧光免疫法(FIA)、放射免疫法(RIA)和酶免疫法(EIA)，前两种方法因试剂存放不便和需特殊仪器，已不常用。在农药残留分析中主要使用酶免疫法中的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。不论用何种方法，都是基于农药和半抗原—载体复合物对特异性抗体的竞争结合反应。
酶联免疫吸附测定法是将抗体抗原反应的高度特异性、敏感性与酶的高度催化性有机地结合，在聚苯乙烯反应板上进行农药残留分析的方法。可分为直接竞争法和间接竞争法（见图）。
直接竞争法 将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加入酶标记农药和待测农药，酶标记农药与待测农药之间发生与抗体的竞争结合反应。反应完成后，将反应液倒掉并进行洗涤。在反应板上加入酶底物，经酶催化而得有色产物。含待测农药多，被结合到包被抗体上的酶标记农药少，颜色减弱。反之，颜色增强。根据已知量农药的标准曲线，可定量测定待测农药的浓度(图a); 在直接竞争法中，也可将人工抗原包被到反应板上，再加入酶标记抗体和待测农药，结合在反应板上的酶标抗体的量与溶液中待测农药的含量成反比(图b)。

酶联免疫吸附测定法(a)
(据B.M.Kaufman,1991)
(a)抗体包被直接竞争法；

酶联免疫吸附测定法(b)
(据B.M.Kaufman,1991)
(b)抗原包被直接竞争法

间接竞争法 前一部分与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记抗农药抗体（一抗）而是标记第二抗体，如酶标羊抗兔抗体，简称酶标二抗，在竞争结合反应之后，加入酶标二抗，使之与一抗结合，被结合的酶标二抗的量与包被抗原结合的一抗的数量变化趋势是一致的，即被结合的酶标二抗的量与待测农药的量成反比。此法的特点是一个抗农药抗体可以结合多个酶标二抗，提高了方法的灵敏度(图c)。

酶联免疫吸附测定法(c)
(据B.M.Kaufman,1991)
(c)间接竞争法

应用前景 早期使用的荧光免疫法灵敏度低，迅速被灵敏度高的放射免疫法取代，但同位素标记农药不易得到，且对人体有害，不适于现场监控；酶免疫法，特别是酶联免疫吸附测定法，灵敏度高(可达10^-12克数量级)，还可减少样本的前处理和纯化步骤，测定快速，适于现场监控，是农药免疫检测技术中最有发展前途的方法。免疫检测法的缺点是：抗体制备难度大，且抗体有特异性，只能用于单个农药的测定，不适用于多残留分析。作为现行的气相色谱和液相色谱法的补充，它将在新鲜水果、蔬菜、食品、土壤、水和人畜中毒等现场监控方面得到广泛应用。