DNA复制DNA replication

DNA分子以一条核苷酸链为模板，在酶的催化下，合成另一条碱基顺序互补的单链，产生新的DNA分子。
半保留复制方式 沃森(J.D.Watson) 和克里克(F.H.Crick) 在发表DNA双螺旋结构模型之后，根据DNA分子两条互补链之间，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对的特性，提出DNA分子是以半保留模板的方式进行复制的，即复制时碱基对之间的氢键断开，形成两条单链，各链的碱基显露。然后以每一条链为模板，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对的原理，吸引带有互补碱基的三磷酸脱氧核糖核苷，在邻接的核苷酸间形成磷酸二酯键，合成一条新的互补链。新形成的两个子代DNA分子与亲代分子的碱基顺序完全一样，而每个子代分子的双链中都保留一条亲代DNA链，因此称作半保留复制。1958年梅塞尔森(M.Meselson)和斯塔尔(F. W. Stahl) 用密度梯度离心法首次证明了DNA的半保留复制机制。大肠杆菌培养在以15N标记的氯化铵为唯一氮源的培养基中，得到15N-DNA，其密度比正常的DNA(¹⁴N-DNA)的密度约高1%; 在氯化铯密度梯度离心时，这两种DNA形成位置不同的区带。他们发现，如果用普通培养基(含14N的氮源)培养15N标记的大肠杆菌，经过一代以后，全部DNA的密度都处在15N-DNA和14N-DNA之间，即形成由15N单链和14N单链组成的杂合DNA分子。两代后，则¹⁴N-DNA分子和¹⁴N～¹⁵N杂合DNA分子等量出现。若再继续培养，14N DNA分子逐渐增多。如果加热_,1⁴N～¹⁵N杂合DNA分子可分开形成¹⁴N链和15N链。在此之后，还进行了一系列的包括对细菌、动植物细胞、噬菌体和动物病毒的有关实验。采用放射自显影方法可以显示两条链局部打开的正在进行复制的DNA分子。根据放射剂量的计算表明，在子代DNA分子中有一半来自亲代分子。
复制过程 在DNA复制过程中，在DNA聚合酶的作用下，总是以三磷酸脱氧核苷的5位磷酸与DNA链上3′端的3′位羟基缩合，形成3′-磷酸酯键，即DNA的复制是沿5′→3′端的方向进行的。复制时，RNA聚合酶辨认复制起点，由解链蛋白和解旋蛋白与DNA双链上的每一条链结合，促使DNA双链局部解开。每个复制点的形状像个叉子，故称作复制叉。从复制叉处起始的两条核苷酸链的合成速度和方式是不同的。其中3′→5′方向的链是先导链，以此链为模板的新DNA链的合成沿5′ →3′方向连续地进行，复制速度较另一条链快。另一条链的复制却不能连续地进行。1968年日本冈崎等发现5′ →3′方向的DNA复制，是先沿5′→3′方向合成不连续的DNA片段（称作冈崎片段） 的方式进行的。即在复制叉处单链模板的冈崎片段起点上，由RNA聚合酶催化合成一小段 (50到100个核苷酸)RNA，或结合一小段预先形成的RNA；以此RNA为引物，以DNA单链为模板沿5′→3′方向由DNA聚合酶Ⅲ或相应的DNA聚合酶催化合成冈崎片段，直到另一RNA引物的5′末端； 然后在DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切酶活性作用下，水解除去RNA引物，所出现的缺口由聚合酶催化DNA片段的继续延长来填补。最后由DNA连接酶将所有的冈崎片段连接起来，成为新的DNA链（见图）。DNA复制有单向和双向复制两种。大多数生物的DNA复制为双向复制。细菌和病毒以及线粒体的DNA分子通常是作为一个复制单位（复制子）进行复制的； 但是真核细胞染色体的DNA分子量很大，它们可以在许多起始点上进行双向复制，整个分子由许多复制子所组成。

DNA复制示意图

DNA复制的意义 生物的遗传信息是通过DNA的复制由亲代传递给子代的。DNA半保留复制机制的特征表明，新合成的子代DNA分子准确地保存了亲代DNA分子所携带的所有遗传信息。在最适条件下，插入一个新核苷酸从而发生差错的机率低到10^-8～10^-_9。这种DNA复制的准确性对于生物的繁衍，种系的延续和稳定极为重要。

DNA复制

DNA分子通过自我复制，将遗传信息（即核苷酸顺序）从亲代DNA分子传递给子代DNA分子，这一作用叫做DNA复制。
DNA双螺旋结构 Watson和Crick (1953)应用X射线衍射研究的数据，提出了DNA分子双螺旋结构模型，合理地解释了遗传物质的各种功能，从而建立了分子遗传学的基本理论。DNA双螺旋结构模型的特点如下：
(1)DNA分子是由两条多核苷

图1 DNA分子双螺旋结构模型

酸链构成，这两条多核苷酸链互相平行，而方向相反；即一条链沿磷酸二酯键3′～5′方向； 另一条链则相反，沿5′～3′方向。两条链在空间结构上，以右向螺旋的方式围绕一根想象中的中轴向前延伸(图1)。
(2) 两条多核苷酸链在外侧各有一条磷酸和脱氧核糖的长链作为基本骨架；内侧则为碱基。碱基对处于同一平面，并与双螺旋“中轴”垂直，所有碱基对均互相平行重叠。DNA双螺旋的直径为20，每个螺距的长度为34A，一个螺距包含着10个核苷酸对，因而相邻核苷酸之间距离为3.4。
(3)DNA双螺旋结构的最重要特点是碱基配对原则，即一条多核苷酸链的腺嘌呤(A)

图2 DNA互补链反向平行

必定与另一条链的胸腺嘧啶(T)配对，A与T之间通过二个氢键相联系； 而一条链的鸟嘌呤(G)必定与另一条链的胞嘧啶(C)配对，其间借三个氢键相连。可以简单表示为A=T,G≡C。A与T,G与C均称为互补碱基(图2)。
由于DNA分子两条多核苷酸链之间处于同一平面的碱基呈互补关系，因而DNA分子两条链亦成互补关系——互补链。
DNA复制 DNA分子中的核苷酸对常多达数百万，如大肠杆菌的DNA分子就有3×10⁶核苷酸对，而且严格地按一定顺序排列着。为了说明生物体如何精确地将遗传信息从亲代传到子代，以保持其遗传的连续性和稳定性，Watson和Crick设想当DNA复制时，DNA分子的双链先解开成两条单链。然后以每一条原有的单链为模板，各自互补地同胞核内游离的核苷酸进行碱基配对，形成一条互补的新多核苷酸链。结果，一个亲代DNA分子，复制成两个结构完全相同的子代DNA分子，每一个子代DNA分子均由一条原有的链和一条新链组成，这就称为半保留复制。Meselson等(1958)，应用密度梯度离心技术，证实了DNA半保留复制的正确性。他们将大肠杆菌置于含有同位素重氮(¹⁵N)的培养基内繁殖，生长几代后，所有大肠杆菌的DNA均含¹⁵N，比正常的含¹⁴N的DNA密度大些。再将DNA被¹⁵N标记的大肠杆菌放回含¹⁴N的普通培养基内繁殖1～2代，然后将各代的DNA取样，进行氯化铯密度梯度离心。通过紫外吸收光谱来测定DNA的位置和浓度。Meselson发现，从¹⁵N培养基转移到¹⁴N培养基中进行第一次分裂后的大肠杆菌的DNA，出现一条中间型带，位于重氮带 (¹⁵NDNA) 与轻氮带(¹⁴NDNA)之间。继而发现，生长于¹⁴N培养基中进行第二次分裂后的大肠杆菌的DNA有二条带，一条为中间型带，还有一条轻氮带。上述实验结果表明，在15N培养基中繁殖几代的大肠杆菌的DNA分子由二条重氮单链(¹⁵N)组成。当大肠杆菌从¹⁵N培养基转入¹⁴N培养基中繁殖第一代时，其DNA分子为一条重氮单链(¹⁵N)和一条轻氮单链(¹⁴N)组成的杂种链。在¹⁴N培养基中繁殖第二代时，其DNA分子出现两种类型，一类为重氮单链和轻氮单链的杂种链，另一类为两条轻氮单链组成的链。实验结果是符合半保留复制设想的(图3)。

图3 DNA半保留复制实验

DNA复制的方式得到证实后，Kornberg(1956)发现了DNA聚合酶，并在以后研究中对DNA复制模型有新的发展，但DNA复制过程是相当复杂的，仅参加这一过程的蛋白质（酶）就有20种，而且各种生物DNA复制的过程不尽相同，有许多问题尚待进一步阐明。
原核细胞的DNA复制
(1) DNA的解旋：在DNA复制前，首先是DNA解旋酶获得能量，推动DNA双螺旋解开，在这基础上，解旋蛋白结合到已经解开的DNA单链，以保持DNA单链处于伸展状态。
(2) 引物的产生：很早就证实，原核细胞内的聚合酶不能在体外催化DNA在起始部位的合成，它需要一种引物，一般是RNA的片段，也可以是DNA片段(引物约为20～30个核苷酸)。诱发引物产生的酶称为引物酶。不同系统的噬菌体的引物酶是不同的。例如M13系统是RNA聚合酶，φX174系统是dnaG蛋白。引物酶具有识别DNA复制起点的功能，并催化RNA引物形成，再在DNA聚合酶作用下沿着新链5′～3′方向合成一条新的互补DNA链。待DNA复制合成后，由核酸酶切掉引物，经DNA聚合酶的修补及连接酶的“焊接”，以保持DNA的完整性。(3) 间断性复制： 在原核细胞DNA复制时出现复制叉的事实表明，DNA在复制开始时，只有部分双螺旋被解开，以后，边解旋边进行复制。已知DNA双链是反向平行的，即一条链为3′～5′方向； 另一条链则为5′～3′方向。业已证明DNA聚合酶以3′～5′方向的单链为模板，沿着新链5′～3′方向催化多核苷酸的互补链合成； 同时，又以5′～3′方向的单链为模板，沿着新链5′～3′方向催化多核苷酸的互补链合成。由此可知新DNA链的合成总是从5′端向3′端进行的(图4)。
1967年Kornberg提出DNA间断复制的设想，以后为冈崎(Okazaki)在大肠杆菌复制中所证实。即在大肠杆菌DNA复制时，先在DNA模板上合成一段50～100个核苷酸的RNA作为引物，再以RNA引物的3′-OH末端为起点，按新链5′～3′方向合成一些1000～2000个核苷酸的片段，称为冈崎片段或称复制片段，在DNA连接酶的催化下，这些片段首尾互相连接，形成一条完整的新的DNA双链。

图4 DNA复制过程

真核细胞的DNA复制 对真核细胞DNA复制的研究，目前还远不及原核细胞这样细致。真核细胞DNA复制中的酶和蛋白因子，与原核细胞的基本相同。但由于真核细胞DNA分子大，且与组蛋白结合等情况，DNA复制应该更为复杂。譬如，真核细胞的一个DNA分子上可以有几个能独立进行复制的复制区，称为复制子，而细菌一个DNA分子仅一个复制子。此外，真核细胞复制的速度比原核细胞慢，这可能与组蛋白和DNA结合有关。RNA复制 有些病毒的遗传物质是RNA。这种RNA病毒在寄主细胞内可以用病毒RNA为模板，在一种高度特异性酶(RNA复制酶)的催化下，按照互补原则合成两条子代RNA链，并经过多次复制，产生更多的病毒RNA分子；另一方面病毒RNA也可以作为模板合成病毒的特异性蛋白质，形成病毒的外壳蛋白质。(见“遗传信息的转译”)